劉 娟，李葉麗，羅云梅，楊丹莉，李利生

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所，貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

循環(huán)系統(tǒng)由肺循環(huán)和體循環(huán)組成。體循環(huán)回心靜脈血經(jīng)右心房、右心室、肺動(dòng)脈及其分支達(dá)肺毛細(xì)血管進(jìn)行氣體交換，靜脈血氧合成動(dòng)脈血經(jīng)肺靜脈再次進(jìn)入體循環(huán)。肺動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)和功能與體動(dòng)脈不同，具有管壁薄，橫切面積大，平滑肌細(xì)胞數(shù)量少，順應(yīng)性高，高灌低阻等特點(diǎn)，能夠較好的緩沖右心室射血量改變引起的肺動(dòng)脈壓波動(dòng)[1]。在一些病理狀態(tài)如肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary artery hypertension，PAH)、肺栓塞等導(dǎo)致肺循環(huán)障礙，肺動(dòng)脈壓改變是重要臨床表現(xiàn)和診斷依據(jù)[2]。大鼠是研究肺循環(huán)障礙有關(guān)疾病的常用動(dòng)物，但準(zhǔn)確測量大鼠的肺動(dòng)脈壓較為困難。目前，采用導(dǎo)管測量肺動(dòng)脈壓是最為常用的方法[3-4]，章新華等[5]對(duì)該方法進(jìn)行了較為詳細(xì)的介紹，但一些關(guān)鍵技術(shù)如導(dǎo)管末端的彎曲程度、壓力曲線變化等缺乏直觀的圖解，以致眾多科研人員無法掌握該方法。為此，本文以野百合堿(Monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的大鼠PAH模型為例詳細(xì)介紹中央靜脈導(dǎo)管測量大鼠肺動(dòng)脈壓的方法，供同行參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及主要儀器設(shè)備 SD大鼠12只，♂，體重 200～250 g，SPF 級(jí)，購自中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK( 渝)2012-0005]， SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK( 黔) : 2014-003]，自由進(jìn)食進(jìn)水。MCT購于美國Sigma公司。PowerLab八導(dǎo)生理記錄儀(澳大利亞ADInstrument 公司)，顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus 公司)。中央靜脈導(dǎo)管(Secalon，16 G/1.6×40cm，英國Viggo公司產(chǎn)品)。2把眼科彎平臺(tái)鑷。

1.2 動(dòng)物分組及PAH模型復(fù)制 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組和PAH組，每組6只。對(duì)照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，PAH組單次皮下注射MCT ( 50 mg/kg) 制備PAH 模型，4周后測量肺動(dòng)脈壓，mPAP>25 mmHg者視為造模成功。

1.3 PAP測量方法

1.3.1 材料改制方法 中央靜脈導(dǎo)管塑形：如圖1A，將中央靜脈導(dǎo)管末端套入曲別針，注意彎曲長度，浸入約60 ℃溫水中約10 min，自然冷卻后拔出曲別針，并在導(dǎo)管上標(biāo)記刻度(見圖1B)。6號(hào)注射針頭改裝：距針頭末端2～3 mm處彎曲成直角，針頭末端斜面與彎曲平面一致(見圖1C)，改裝針頭用于頸外靜脈插管處開孔。

圖1 中央靜脈導(dǎo)管和6號(hào)注射針頭改造示意圖

1.3.2 設(shè)備連接與調(diào)試 PowerLab八導(dǎo)生理記錄儀經(jīng)壓力換能器與中央靜脈導(dǎo)管連接，定標(biāo)，并采用袖帶式血壓計(jì)校驗(yàn)壓力信號(hào)的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)中須固定中央靜脈導(dǎo)管末端與壓力換能器的垂直高度差。

1.3.3 分離頸外靜脈 大鼠術(shù)前禁食過夜，腹腔注射10%水合氯醛(2 mL/kg)進(jìn)行麻醉。仰臥位固定，右側(cè)鎖骨上緣延鎖骨中線作約1.5 cm切口，延鎖骨中線分離皮下組織，暴露并分離頸外靜脈至鎖骨上緣，穿線備用(見圖2)。

圖2 大鼠頸靜脈解剖結(jié)構(gòu)、插管手術(shù)切口示意圖

1.3.4 插管 使用止血鉗向大鼠頭端牽引備用線，使頸外靜脈處于輕微拉伸狀態(tài)，左手持眼科彎鑷牽拉頸外靜脈遠(yuǎn)心端，右手持6號(hào)注射針頭于鎖骨上緣0.5 cm頸外靜脈膨大處刺破血管壁，并向近心端拉扯刺破點(diǎn)以擴(kuò)大血管破損口，然后左手所持眼科彎鑷伸入破損口替換注射針頭，張開眼科彎鑷雙臂，右手持另一把眼科彎鑷夾持中央靜脈導(dǎo)管末端并將其送入頸外靜脈。隨后，導(dǎo)管弓背向腹側(cè)、末端指向背側(cè)沿頸外靜脈向近心端推進(jìn)以跨過鎖骨，然后將導(dǎo)管順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°，導(dǎo)管末端向左繼續(xù)推進(jìn)約2 cm進(jìn)入右心房并接近右房室口，此時(shí)緩慢推進(jìn)導(dǎo)管，輕微調(diào)整導(dǎo)管末端方向，進(jìn)入右心室。保持導(dǎo)管方向不變，輕微推進(jìn)即可進(jìn)入肺動(dòng)脈。根據(jù)壓力曲線變化判斷導(dǎo)管位置。

1.3.5 評(píng)價(jià)右心室肥厚、肺動(dòng)脈重構(gòu)情況 PAP測量完成后放血處死大鼠，分離心臟， 剪去心耳及血管，完整剝離右心室壁，分別對(duì)右心室壁和剩余部分即左心室+室間隔稱重， 根據(jù)公式“右心室壁質(zhì)量/(左心室質(zhì)量+室間隔質(zhì)量)”計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(Right ventricular hypertrophy index，RVHI)。取肺組織石蠟包埋、切片、H&E 染色，觀察肺血管形態(tài)學(xué)變化，測定血管截面積和血管腔截面積， 計(jì)算“(血管截面積-血管腔截面積)/血管截面積×100%”， 即血管壁面積占總面積的百分比(WA%)。

2 結(jié)果

2.1 導(dǎo)管位置與壓力曲線的對(duì)應(yīng)關(guān)系 壓力曲線變化是判斷導(dǎo)管位置的關(guān)鍵依據(jù)。如圖3所示，當(dāng)導(dǎo)管末端到達(dá)右心房時(shí)壓力曲線波動(dòng)幅度小，壓力較低。隨后導(dǎo)管弓背向右，末端向左緩慢推進(jìn)，當(dāng)導(dǎo)管進(jìn)入右心室時(shí)壓力曲線波動(dòng)幅度增大，壓力增高。此時(shí)，保持導(dǎo)管方向和角度不變，繼續(xù)輕微緩慢推進(jìn)導(dǎo)管進(jìn)入肺動(dòng)脈，壓力曲線波動(dòng)幅度降低，收縮壓與右心室收縮壓相當(dāng)，但高于右心房壓。可見，右心房、右心室和肺動(dòng)脈的收縮壓、舒張壓和脈壓差區(qū)別明顯，根據(jù)各部位壓力曲線特征確定導(dǎo)管末端位置是可靠的。

圖3 導(dǎo)管位置與壓力曲線的對(duì)應(yīng)關(guān)系

2.2 MCT-PAH模型肺動(dòng)脈壓變化 在PAH組，6只大鼠平均肺動(dòng)脈壓均大于25 mmHg，成模率為100%。如圖4，對(duì)照組肺動(dòng)脈收縮壓16.6 mmHg，舒張壓2.5 mmHg，平均壓10.2 mmHg。PAH組肺動(dòng)脈收縮壓46.8 mmHg，舒張壓16.5 mmHg，平均壓29.2 mmHg，均顯著高于對(duì)照組。

*：與對(duì)照組比較， P< 0.05。圖4 MCT-PAH模型肺動(dòng)脈壓變化

2.3 MCT-PAH模型肺動(dòng)脈重構(gòu)、RVHI變化 MCT-PAH模型肺動(dòng)脈管壁肥厚、管腔狹窄，重構(gòu)明顯，量化分析顯示PAH組WA%顯著高于對(duì)照組(見圖5A)。肺動(dòng)脈壓增高導(dǎo)致右心室壓力型肥厚，如圖5B所示，PAH組RVHI顯著增高(P< 0.05)。

*：與對(duì)照組比較，圖5 MCT-PAH模型肺動(dòng)脈重構(gòu)、RVHI變化

2.4 mPAP與WA(%)、RVHI相關(guān)性分析 如表1所示，在MCT-PAH模型中，mPAP與WA及RVHI的變化成顯著正相關(guān)。

表1 mPAP與WA及RVHI相關(guān)性分析

變量mPAPrPWA(%) 0.7400.021RVHI0.930<0.001

3 討論

肺動(dòng)脈高壓是由多種已知或未知原因引起的肺動(dòng)脈壓異常升高的一種病理生理狀態(tài)，血流動(dòng)力學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)為：在海平面、靜息狀態(tài)下，右心導(dǎo)管測量mPAP≥25 mmHg。多普勒超聲心動(dòng)圖估測肺動(dòng)脈收縮壓、右心導(dǎo)管測定平均肺動(dòng)脈壓是診斷肺動(dòng)脈高壓的主要檢測方法，后者是診斷肺動(dòng)脈高壓的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。

MCT-PAH大鼠模型具有操作簡單、成模快、成模率高、不需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，是研究肺動(dòng)脈高壓常用的疾病模型[7]。同樣，測定該模型的mPAP是評(píng)價(jià)模型是否復(fù)制成功的金指標(biāo)。受大鼠體型的影響，測量MCT-PAH模型大鼠的mPAP較為困難，常用的測量主要可分為間接測量法、估測法和直接測量法。間接測量法即以右心室壓反應(yīng)肺動(dòng)脈壓，操作方法包括開胸后直接將導(dǎo)管置入右心室或經(jīng)頸外靜脈、右心房將導(dǎo)管置于右心室兩種方式，右心室壓受回心血量、射血后心室剩余血量、右心室收縮力和右心室后負(fù)荷及肺動(dòng)脈壓等多種因素影響，右心室壓與肺動(dòng)脈壓存在較大差異[8-9]。估測法是通過超聲心動(dòng)圖和多普勒超聲估測三尖瓣峰值流速或肺動(dòng)脈收縮壓[10-11]，是臨床篩查肺動(dòng)脈高壓最重要的無創(chuàng)性檢測方法，但多數(shù)科研實(shí)驗(yàn)室不具備所需的專業(yè)設(shè)備和技術(shù)。直接測量法即本文介紹的方法，該方法測量結(jié)果準(zhǔn)確，但操作技術(shù)難度較大。

本文介紹的方法須注意以下若干要點(diǎn)：① 導(dǎo)管的選擇和改造。中央靜脈導(dǎo)管(16 G/1.6×400 mm)的管徑、柔軟程度最為理想，而且易塑形，常溫下不易變形。② 頸外靜脈切口。頸外靜脈切口應(yīng)位于鎖骨上緣約0.5 cm處，此處頸外靜脈管徑較粗，易于導(dǎo)管進(jìn)入。③ 導(dǎo)管進(jìn)入的長度和末端方向是操作成功的關(guān)鍵。導(dǎo)管進(jìn)入頸外靜脈后首先需跨過鎖骨，導(dǎo)管應(yīng)弓背向腹側(cè)、末端指向背側(cè)向近心端推進(jìn)。隨后將導(dǎo)管順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°，導(dǎo)管末端水平向左繼續(xù)推進(jìn)即可進(jìn)入右心房。導(dǎo)管通過右房室孔進(jìn)入右心室較為困難，不同體重的大鼠，鎖骨距離右房室孔的距離略有差異，200 g體重的大鼠約為2 cm，根據(jù)導(dǎo)管刻度判斷，并始終保持導(dǎo)管末端水平向左，緩慢推進(jìn)導(dǎo)管并輕微旋轉(zhuǎn)導(dǎo)管，以進(jìn)入右心室。導(dǎo)管經(jīng)右心室進(jìn)入肺動(dòng)脈更需精細(xì)操作，保持導(dǎo)管弓背向尾端，末端彎向頭端，輕微推進(jìn)即可進(jìn)入肺動(dòng)脈，導(dǎo)管推進(jìn)中管口易貼壁，出現(xiàn)壓力較高、波動(dòng)小甚至無波動(dòng)曲線，須與肺動(dòng)脈壓力曲線加以區(qū)別。④ 導(dǎo)管的確切位置需根據(jù)各位置壓力曲線判斷。

MCT-PAH模型肺微小動(dòng)脈重構(gòu)是mPAP進(jìn)行性增高的原因，mPAP增高導(dǎo)致右心室壓力負(fù)荷性肥厚，三者為因果關(guān)系，變化趨勢可以相互印證。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCT-PAH模型肺微小動(dòng)脈重構(gòu)明顯，mPAP和RVHI顯著增高，而且WA、RVHI與mPAP改變呈顯著正相關(guān)，表明本文介紹的肺動(dòng)脈壓測量方法結(jié)果是準(zhǔn)確的。