張翠英，俞 捷，劉廣學，徐 風，尚明英，李耀利，王 璇，小松かつ子，朱 姝，蔡少青＊＊

（1.北京大學藥學院 北京 100191；2.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京 100053；3.云南中醫(yī)藥大學 昆明 650500；4.日本富山大學和漢醫(yī)藥學綜合研究所 富山 930-0194）

因美國《Sci Transl Med》雜志2017 年刊登的馬兜鈴酸及其衍生物在臺灣和亞洲地區(qū)與肝癌相關(guān)的論文[1]，醫(yī)藥學界及民眾中又引發(fā)了關(guān)于含馬兜鈴酸藥物毒性的討論熱潮。馬兜鈴科中含馬兜鈴酸中藥成為熱門話題，其中也包括常用的辛溫解表藥細辛。國家食品藥品監(jiān)督管理局為此于2017 年10 月又連續(xù)推出了有關(guān)馬兜鈴酸的公告，介紹含馬兜鈴酸藥品使用的安全情況；《中國中醫(yī)藥報》和《人民日報》等也相繼發(fā)表評論，引導民眾正確看待含馬兜鈴酸藥品使用的安全性以免引起民眾恐慌。其實自2003年以來，我國政府部門已對含馬兜鈴酸藥材及中成藥采取了一系列風險控制措施，包括取消馬兜鈴酸含量高的關(guān)木通、廣防己和青木香的藥用標準；以及將細辛的藥用部位由全草修訂為根和根莖。然而相關(guān)馬兜鈴酸在中藥細辛分布的研究文獻存在實驗所用樣本較少（1-7 份）、數(shù)據(jù)的代表性差等問題[2-4]，易引發(fā)一些讀者誤解而造成民眾用藥的恐慌。

圖1 3種馬兜鈴酸和2種馬兜鈴內(nèi)酰胺的化學結(jié)構(gòu)

細辛來源于馬兜鈴科植物北細辛Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、華細辛A.sieboldiiMiq.或漢城細辛A.sieboldiiMiq.var.seoulenseNakai。本課題組自1990年始，長期從事細辛的本草考證[5,6]、藥材鑒定[5,7-9]、資源分布[5,10]、藥效作用[11,12]、活性成分[13-17]和馬兜鈴酸類成分[18-20]等多方面研究工作。為了應對這次馬兜鈴酸風波，讓公眾了解馬兜鈴酸類成分在中藥細辛中的分布和含量情況，有必要對細辛中具有毒性的馬兜鈴酸類成分的分布和含量情況進行較全面系統(tǒng)的報道，以利于細辛臨床安全和合理用藥。因此，我們整理了本課題組多年來有關(guān)細辛的研究結(jié)果，并開展了一些重復實驗對以往的實驗結(jié)果進行確證，形成本論文。本文采用HPLC-DAD 法，以3 種馬兜鈴酸及2 種馬兜鈴內(nèi)酰胺即馬兜鈴酸I（aristolochic acid I；AA-I）、馬兜鈴酸II（AA-II）、9-羥基馬兜鈴酸I（9-hydroxy aristolochic acid I；9-OH AAI）、馬兜鈴內(nèi)酰胺I（aristololactam I；AL-I）和馬兜鈴內(nèi)酰胺II（AL-II）作為測定的指標成分，對中國藥典收載的北細辛、華細辛和漢城細辛3 種植物的不同部位（果、葉、根及根莖）進行大樣本的含量分析。

1 材料

1.1 儀器

HP1100型高效液相色譜儀包括四元泵、在線脫氣機、柱溫箱及DAD 檢測器（美國安捷倫公司）；API 3000 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀（Perkin-Elmer Sciex Instruments 公司）；十萬分之一的Sartorius 電子天平（德國Denvor 公司）；超聲波清洗機（功率500W，天鵬電子新技術(shù)有限公司）；高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 對照品與試劑

AA-I、AA-II 混合對照品購于Sigma 公司（Lot 092K1249）（St. Louis，MO，USA），AA-I 和AA-II 各占40% 、56% ，作者采用半制備高效液相色譜儀分離純化；AL-I 和AL-II 為AA-I 和AA-II 的合成品，亦采用半制備高效液相色譜儀分離純化；9-OH AA-I 對照品為作者從天仙藤（北馬兜鈴Aristolochia contortaBge.的莖葉）中分離純化獲得[20]，這些化合物均經(jīng)核磁、質(zhì)譜等方法進行結(jié)構(gòu)鑒定。9-OH AA-I、AL-II、AA-II、AL-I 和AA-I 對照品的純度分別為99.13% 、98.81% 、98.20% 、98.69% 和99.48% ，其相應的化學結(jié)構(gòu)見圖1。

乙腈（HPLC級）美國Fisher公司提供；磷酸（HPLC級）Tedia 公司提供；高純水為北京大學醫(yī)學部醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心提供，并經(jīng)0.45 μm水系濾膜濾過；其它均為分析純。

1.3 細辛藥材

本實驗所用樣品采自細辛的主產(chǎn)區(qū)，其中北細辛和漢城細辛采于主產(chǎn)區(qū)遼寧省本溪、撫順和丹東等遼東地區(qū)；華細辛采于主產(chǎn)區(qū)陜西省，采集地遍及2 省7縣12個鄉(xiāng)鎮(zhèn)18個自然村。采集時間跨越13年和細辛生長的夏、秋、冬3個季節(jié)（5月至11月）。采集共計81份全草樣品和16份全草商品，其中30份樣品帶果（用*在編號右上角注明）。研究中將細辛樣品分為細辛果、細辛葉、細辛根及根莖3 個部位。所有樣品均經(jīng)北京大學藥學院蔡少青教授鑒定，憑證標本保存于北京大學藥學院生藥標本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC色譜條件

Zorbax SB-C18（4.6 mm×25 cm，5 μm）色譜柱和Zorbax SB-C18（4.6 mm×1.3 cm，5 μm）保護柱（美國安捷倫公司）。流動相為乙腈-7.4mM 磷酸緩沖液（pH=2.34）梯度洗脫，0→15 min，40% 乙腈；15→16 min，40% 乙腈→45% 乙腈；16→29 min，45% 乙腈；29→30 min，45% 乙腈→100% 乙腈。流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，進樣量20 μL。

2.2 LC-MS條件

Zorbax SB-C18（4.6 mm×25 cm，5 μm）色譜柱和Zorbax SB-C18（4.6 mm×1.3 cm，5 μm）保護柱（美國安捷倫公司），ESI 離子源（正離子源），以m/z359→324，m/z359→298，m/z359→296 三對母子離子對進行多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring,MRM）。流動相為乙腈-水（0.2% 醋酸和1mM 醋酸銨）進行梯度洗脫，流速：0.6 mL?min-1，進樣量20 μL。

表1 3種馬兜鈴酸及2種馬兜鈴內(nèi)酰胺的標準方程

2.3 供試品溶液的制備

分別精密稱取細辛的果、葉或根及根莖樣品（粉碎過40目篩）0.5 g，置于具塞三角瓶中，精密加入70% 甲醇25 mL，稱重，超聲處理40 min，用70% 甲醇補足失重，過濾，續(xù)濾液過0.45 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。所有細辛的樣品液制備、HPLC 含量測定及LCMS法檢測的前期工作均系于2003年9月-2004年4月期間內(nèi)完成。

2.4 HPLC的方法學考察

2.4.1 標準曲線的制備及檢測限

精密稱取AA-I、AA-II、9-OH AA-I、AL-I、AL-II對照品適量，加甲醇分別配制成系列標準溶液（AA-I：

0.53、2.65、5.30、10.60、15.90、21.20、26.50 μg·mL-1；AA-II：0.376、0.940、1.504、1.880、2.444、3.196、3.760 μg·mL-1；9-OH AA-I：0.2、0.5、0.8、1.0、1.3、1.7、2.0 μg·mL-1；AL-I：0.468、1.170、1.872、2.340、3.042、3.878、4.680 μg·mL-1；AL-II：2.04、4.08、6.12、8.16、10.20、14.28、20.40 μg·mL-1）的溶液。進樣量20 μL，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，回歸計算標準方程（表1）。以電信號是噪音的三倍時的濃度為檢測限。混合對照品及細辛樣品分離情況見圖2。

2.4.2 精密度試驗

取同一份供試品溶液（編號為025008 果）連續(xù)進樣5次，每次20 μL，根據(jù)5次的峰面積積分值，計算馬兜鈴酸及馬兜鈴內(nèi)酰胺的含量，并計算RSD，AA-I、9-OH AA-I、AL-I、AL-II 的RSD分別為0.56% 、1.08% 、0.97% 和2.92% ，說明儀器的精密度良好。

2.4.3 重復性試驗

圖2 混合對照品和細辛樣品的HPLC色譜圖

取同一份樣品（編號為025008果）5份，每份0.5 g，照供試品溶液制備方法制得5 份供試品溶液，進樣20 μL，根據(jù)5 次的峰面積積分值，計算馬兜鈴酸及馬兜鈴內(nèi)酰胺的含量，并計算RSD，AA-I、9-OH AA-I、AL-I、AL-II 的RSD分別為2.55% 、0.74% 、0.72% 和2.45% ，說明供試品溶液的重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液（編號為025008果），每隔2 h進樣一次，連續(xù)進樣7次，根據(jù)峰面積積分值計算馬兜鈴酸及馬兜鈴內(nèi)酰胺的含量，并計算RSD，AA-I、9-OH AA-I、AL-I、AL-II 的RSD分別為0.11% 、0.66% 、0.31% 和0.95% ，說明供試品溶液在12小時內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗

精密稱取細辛果（編號025008）粉末6 份，分別加入3 種馬兜鈴酸及2 種馬兜鈴內(nèi)酰胺混標溶液（AA-I 0.26 mg·mL-1、AA-II 0.032 mg·mL-1、9-OH AA-I 0.024 mg·mL-1、AL-I 0.0366 mg·mL-1、AL-II 0.0959 mg·mL-1）1mL，照供試品溶液的制備方法得到加樣供試品溶液，進樣20 μL，計算3種馬兜鈴酸及2種馬兜鈴內(nèi)酰胺的加樣回收率和RSD（% ），AA-I、AA-II、9-OH AA-I、AL-I、AL-II 的平均加樣回收率分別為99.4% （RSD為0.62% ）、98.0% （RSD為1.08% ）、100.0% （RSD為0.38% ）、100.0% （RSD為0.36% ）和99.6% （RSD為1.55% ）。

2.5 樣品測定結(jié)果

將30 份帶有果的樣品分為果、葉和根及根莖3 部分；將無果的67份樣品分為葉和根及根莖2部分。通過與3種馬兜鈴酸及2種馬兜鈴內(nèi)酰胺對照品的保留時間和DAD檢測器的UV光譜圖比對進行樣品中相應色譜峰的指認，根據(jù)峰面積積分值計算3 種馬兜鈴酸及2種馬兜鈴內(nèi)酰胺的含量，北細辛、漢城細辛和華細辛的不同部位的含量結(jié)果分別見表2-表4，HPLC的綜合檢測結(jié)果見圖3。其中97份細辛根及根莖樣品均未檢測到3種馬兜鈴酸及2種馬兜鈴內(nèi)酰胺中任何一種成分；葉和果中均未檢測到AA-II；AA-I在細辛果和葉（除了2 份葉樣品）中均有分布，但含量差異較大；9-OH AA-I、AL-I和AL-II只在細辛果中檢測到，而葉中均未檢測到這3種成分。

2.6 細辛根及根莖中微量的AA-I的確認

為進一步確認AA-I 在細辛根及根莖究竟是否確有微量分布，分別取2份北細辛（編號1194和025081）和2份華細辛（編號951015和1161）的根及根莖樣品，采用高靈敏度LC-MS 法進行檢測。將AA-I 的359.4[M+NH4]+碎片進行MS2，結(jié)果母離子m/z359 的碎片為m/z359、342、324、296、298，與文獻報道[4]一致，對離子碎片的解析也非常合理。根據(jù)AA-I 的一級和二級MS，選擇母離子m/z359 與子離子m/z324、298、296 三對離子碎片進行MRM檢測，結(jié)果在4份細辛根及根莖中均檢測到AA-I。根據(jù)峰面積積分值計算，4 份細辛根及根莖中AA-I的含量分別為0.4、1.7、1.3、2.4 μg?g-1。

3 討論

3.1 供試品溶液制備的優(yōu)化

本實驗以3 種馬兜鈴酸及2 種馬兜鈴內(nèi)酰胺為指標，分別對不同提取溶媒（乙醇、乙腈-7.4 mM 磷酸緩沖液（pH=2.34）、50% 甲醇、70% 甲醇、85% 甲醇、甲醇和四氫呋喃）、不同提取方法（超聲提取法、冷浸提取法、熱回流提取法）、不同提取時間（20、40 和60 min）和不同溶媒量（10 mL、25 mL、50 mL、100 mL）進行了考察，最終確定以50 倍70% 甲醇為提取溶媒、超聲提取40 min的制備方法。

3.2 細辛根及根莖中AA-I的檢測

馬兜鈴酸是廣泛存在于馬兜鈴科植物的硝基菲酸，因馬兜鈴酸被報道與腎病和肝癌等發(fā)生相關(guān)而廣受關(guān)注，主要包括AA-I、AA-II等化合物[21]，其中AA-I是導致腎毒性和致癌性的主要成分[21-25]。鑒于AA-I的LC-MS 法檢測靈敏度（檢測限為4.6 ng·mL-1）高于HPLC-DAD 法（檢測限為10.6 ng·mL-1；相當于生藥中AA-I的檢測檢測限為0.53 μg?g-1），本研究測定4份細辛根及根莖樣品的LC-MS檢測結(jié)果表明，盡管在本實驗HPLC 色譜條件下難以檢測到AA-I 在細辛根及根莖的存在，但AA-I 在細辛根及根莖確有微量的分布，即4 份細辛根及根莖中AA-I 的含量分別為0.4、1.7、1.3、2.4 μg?g-1。薛燕等[3]曾報道測定7份細辛（根及根莖；但未給出物種名稱）中AA-I含量為0.476-5.00 μg?g-1；Zhao Z Z 等[4]也曾報道AA-I 含量在漢城細辛（1 份根）和北細辛（2 份根）中分別為0.19、2.16 和0.93 μg?g-1；而按照本研究HPLC 實驗的檢測限可以推測，即使本研究中97 份細辛根及根莖中均分布有少量AA-I，其含量也應該在0.53 μg?g-1以下（考慮到與LC-MS 方法間的測定誤差，此數(shù)值可提升至約2.5 μg?g-1以下）而遠低于《中國藥典》規(guī)定的限度10 μg?g-1，這對薛燕等及Zhao Z-Z等[3,4]的結(jié)果是一個支持。

3.3 細辛藥用部位的取舍探討

根據(jù)本實驗HPLC和LC-MS法檢測3種馬兜鈴酸及2種馬兜鈴內(nèi)酰胺在細辛3個藥用部位的總體分布（圖4 和表5），2 種馬兜鈴酸及2 種馬兜鈴內(nèi)酰胺分布于細辛的果，其中AA-I含量高達2.2 mg?g-1，接近于青木香（Aristolochia debilis根）和馬兜鈴（A.contorta果）的含量級別[26-28]；AA-I也存在于細辛葉（最高達0.140 mg?g-1）中，含量接近于天仙藤（A.contorta地上部分）中AA-I的含量級別[26]。薛燕等[3]曾報道測定7份細辛莖葉（未給出物種名稱）中AA-I 含量為0.0059-0.071 mg?g-1；Zhao Z Z 等[4]也曾報道AA-I 含量在2 份北細辛地上部分中為0.0061-0.0119 mg?g-1；本研究測得的細辛葉中AA-I最高含量是這2篇文獻中含量數(shù)據(jù)的2-10倍，提示細辛葉中AA-I含量變化范圍較大，存在導致安全問題的風險，而以往文獻僅測定少數(shù)樣品不足以充分反映AA-I 的含量情況。本草古籍原本記載細辛藥用部位為根（含根莖）[5,6]，但因資源匱乏、用量緊缺等原因而導致20 世紀60 年前后細辛以全草代替了本草記載的根及根莖[6]，致使2000 版以前的《中國藥典》均記載細辛的藥用部位為全草（而同期的及當前的《日本藥局方》均始終記載根及根莖作為細辛的藥用部位）。故基于本課題組的數(shù)據(jù)及修訂建議，自2005年版始，《中國藥典》收載的細辛藥用部位訂正為北細辛、華細辛或漢城細辛的根及根莖[29]，而不再是全草。為保證細辛的用藥安全，2010年版《中國藥典》又根據(jù)本課題組的建議增加了AA-I 的HPLC 限量檢查，規(guī)定AA-I 不得過0.001%[30]；規(guī)定這個限量主要是為了防止細辛地上部位特別是葉柄殘基混入細辛藥材，而不是為了防止細辛藥材（根及根莖）本身的AA-I超標。

表2 3種馬兜鈴酸及2種馬兜鈴內(nèi)酰胺在北細辛不同部位的分布

續(xù)表

表3 3種馬兜鈴酸及2種馬兜鈴內(nèi)酰胺在漢城細辛不同部位的分布

表4 3種馬兜鈴酸及2種馬兜鈴內(nèi)酰胺在華細辛不同部位的分布

圖3 北細辛、漢城細辛和華細辛中5種成分的HPLC檢測結(jié)果

表5 3種馬兜鈴酸及2種馬兜鈴內(nèi)酰胺在細辛不同部位的總體分布

圖4 3種細辛不同部位中3種馬兜鈴酸及2種馬兜鈴內(nèi)酰胺總量的分布圖

3.4 有關(guān)英國學者[31]報道細辛含大量馬兜鈴酸衍生物的質(zhì)疑

近期英國學者報道細辛屬植物中檢測到大量馬兜鈴酸衍生物，尤其是強調(diào)中國藥典品種細辛（北細辛和華細辛的根及根莖）中也檢測到大量的馬兜鈴酸及馬兜鈴內(nèi)酰胺類；我們仔細研讀該文，發(fā)現(xiàn)該論文既沒有進行定量測定也沒有其他充分可靠的實驗資料支撐其結(jié)論。該論文中存在的主要問題如下。

3.4.1 該論文中的多數(shù)實驗樣品均未準確鑒定物種，實驗結(jié)果應用在《中國藥典》細辛“頭上”不妥。

我們發(fā)現(xiàn)該論文[31]中存在細辛來源不清（未能鑒定到具體物種）的問題：即總共38 份細辛屬樣品中有31 份為商品，因多數(shù)樣品（27 份）無法鑒定具體的物種，故只在括號內(nèi)標注可能為細辛屬植物或具體哪個種的細辛屬植物。僅有4份商品（32、33、35和36號樣品）被明確地鑒定為《中國藥典》收載的細辛。作者把市場上被叫做“Xixin”的商品藥材簡單地認為不是來源于華細辛就是來源于北細辛（見原文第5 頁左列第19-21 行），這樣未能準確鑒定物種的樣品有27 份之多，這種“想當然地認定藥材基源”的做法很不科學。

我課題組在以往資源調(diào)查研究過程中，發(fā)現(xiàn)一些地區(qū)把非藥典收載的細辛屬植物如杜衡A.forbesii、青城細辛A.splendens等作為“細辛”藥用[10]，而藥材碎斷、無花果的細辛商品藥材一般人常常難以鑒定具體物種，混雜或冒充的細辛難免進入流通領(lǐng)域。所以該論文[31]通過檢測被認為可能為《中國藥典》收載的“細辛”樣品，從而就做出細辛中可檢測到較大量馬兜鈴酸類衍生物的結(jié)論未免太武斷了。

3.4.2 既未進行定量研究又無充分的實驗資料，不足以支撐做出“《中國藥典》細辛中含有多種馬兜鈴酸及其類似物因而構(gòu)成用藥安全”的結(jié)論。

（1）該論文作者[31]采用LC-MS法對樣品中16種馬兜鈴酸和馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分進行定性分析，無具體含量數(shù)據(jù)，只用以峰面積大小表示的熱圖（heat map）來表示馬兜鈴酸類衍生物的含量高低。

（2）該論文作者[31]在論文前言中提及AA-I和AAII 是主要的腎毒性成分，然而AA-II 在38 份細辛屬樣品均未檢出。而腎毒性最大的AA-I 只在4 份實驗樣品中檢出，其中僅一份北細辛（其編號為32號，但其植物部位雖然在TABLE1 中標明為“根及根莖”，而在FIGURE1 中卻標示為“葉”。我們根據(jù)該論文中35 號及36 號華細辛分別標注為“根及根莖”和“葉”的情況來推斷，32號樣品應該就是“葉”）檢出AA-I，其余3份分別為“細辛”（21 號，未鑒定種的莖）、加拿大細辛A.canadense葉（14號）和青城細辛A.splendens葉（15號）；4份被明確鑒定為中國藥典品種的細辛樣品（北細辛2份和華細辛2 份）中僅1 份北細辛的葉（32 號）中檢測到AA-I。此外，該論文雖然指出細辛屬植物中的AAI 含量在地上部分與根之間沒有差別，但是，我們注意到其實驗結(jié)果是：在38 份樣品中所有能明顯檢測到AA-I 存在的都是葉子或莖的樣品（即上述4 份：14、15、21、32 號樣品），而其他樣品（包括所有的根樣品）中均并未檢測到AA-I的存在（這說明該論文的實驗結(jié)果也表明細辛屬植物中的AA-I 含量在地上部分與根之間存在差異）。

（3）而對于另一種腎毒性成分AL-I，雖然僅有的4份藥典品種細辛（北細辛和華細辛均葉和根及根莖各1份）中2份根及根莖中均檢測到比葉多的AL-I，然而該論文作者[31]并沒有進行定量研究，未提供其含量數(shù)值。我們本次報告的數(shù)據(jù)顯示，3種細辛原植物（北細辛、華細辛和漢城細辛）的97份葉樣品和97根及根莖樣品中均未檢測到AL-I的存在，只有果實樣品中檢測到了AL-I，而果實中最低檢測到的含量是0.025 mg?g-1；因此《中國藥典》品種細辛的根及根莖中如若存在ALI的話，其含量也應該在0.025 mg?g-1以下。而該論文[31]中其他AL及其他AA類化合物在3份藥典品種樣品中根本沒有檢測到，只有北細辛葉（32 號）中檢測到了AL-CIII（但熱圖強度小于根中AL-I），因此，說《中國藥典》細辛中存在較多量的馬兜鈴酸類衍生物的結(jié)論根本沒有實驗依據(jù)（該論文作者至多只能強調(diào)長尾細辛A.caudatum、青城細辛A.splendens等非藥典細辛中能檢測到較多的AA類和/或AL類化合物）。

3.4.3 鑒于該論文作者[31]在該論文最關(guān)鍵的植物部位名詞表述方面出現(xiàn)不止一處的錯誤，即如上所述把32號樣品的北細辛植物部位搞錯了，同時把38號花葉細辛A. cardiophyllum樣品的部位也搞錯了（TABLE1 中標明為“葉”，而在FIGURE1中標示為“根莖”），甚至據(jù)該論文作者自述（原文第7頁上DISCUSSION的第四段第3-6 行）實驗中他們把根本無法判斷是否是來源于細辛屬植物的一些樣品也拿來當作細辛樣品來進行測定。因此，我們認為該論文所強調(diào)的關(guān)于細辛屬植物的葉或者根（根莖）中馬兜鈴酸衍生物分布情況的結(jié)論的可靠性存在很大的疑問。

4 結(jié)論

本研究通過檢測大量的細辛采集樣品和多省市的細辛商品，報道了3種馬兜鈴酸和2種馬兜鈴內(nèi)酰胺在《中國藥典》收載細辛不同部位中的分布和含量情況，為《中國藥典》（2005 年版）把細辛藥用部位由“全草”修訂為“根及根莖”而保證細辛的臨床用藥安全提供了科學數(shù)據(jù)的支撐。據(jù)HPLC 實驗推測，即使97 份細辛根及根莖中均分布有少量馬兜鈴酸I，其含量應在0.53-2.5 μg?g-1以下。