董翼飛, 鞠化鵬, 楊薏穎, 孫娜, 2, 林松毅, 2*

(1. 大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034；2. 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034)

近年來，以海參為原料所制備的易吸收、高營養(yǎng)效價的海參蛋白肽備受產(chǎn)業(yè)界和科研界重視。研究表明，海參蛋白肽具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、清除自由基以及抑制結(jié)腸癌HT-29等生物學活性[1]，能防止血管末稍收縮，起到降血壓的作用[2]。海參蛋白肽具有很強的抗氧化能力[3]，可以起到延緩衰老[4]、抗疲勞[5]的作用，常與基料粉營養(yǎng)配伍用于高質(zhì)高值化食品開發(fā)。然而，在其加工儲藏的過程中，往往存在吸濕、結(jié)塊等品質(zhì)劣變的問題。隨著貯藏時間的延長，海參蛋白肽粉吸濕后會伴隨變性、變質(zhì)及揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生、多肽質(zhì)構(gòu)變化和功能喪失等問題，嚴重降低了其貯藏穩(wěn)定性，影響其應用[6]。目前國內(nèi)外很少有對于其吸濕特性以及在干燥環(huán)境貯藏過程中其品質(zhì)變化規(guī)律的研究報道。

本研究結(jié)合動態(tài)水分吸附法(dynamic vapor sorption, DVS)、低場核磁共振技術(shù)(low-field nuclear magnetic resonance, LF-NMR)及氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-ion migration spectra, GC-IMS)，對干燥環(huán)境下貯藏的海參蛋白肽粉誘導其揮發(fā)性物質(zhì)進行分析鑒定。DVS可在受控條件下快速準確地獲得吸附數(shù)據(jù)[7]。樓佳穎等[8]利用DVS對不同煙草原料進行了等溫吸濕-解濕行為的研究。LF-NMR是一種快速、無損且低成本的檢測技術(shù)，能很好地反映食品中質(zhì)子的分布和遷移率[9]，從微觀角度闡明樣品中水分的變化規(guī)律。張緒坤等[10]通過LF-NMR研究了胡蘿卜切片在干燥過程中內(nèi)部水分變化的特征。Song等[11]將LF-NMR與MRI技術(shù)相結(jié)合，對鮑魚(Abalone)的水遷移率和分布進行了實時動態(tài)分析。GC-IMS是一種用于分析樣品中揮發(fā)性化合物的檢測方法，具有高分離能力的氣相色譜(GC)對揮發(fā)性物質(zhì)進行預分離，IMS檢測器可對揮發(fā)性組分進行分析[12]。因為GC-IMS聯(lián)用技術(shù)表現(xiàn)出高度的正交性，所以研究的選擇性和峰值容量得到改善[13]，目前已廣泛應用于食品樣品中揮發(fā)性化合物的分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

動態(tài)水分吸附分析儀DVS Advantage RW 33EBSS1/XEU (英國SMS公司)；核磁共振成像分析儀MesoMR23-060V-I (蘇州(上海)紐邁電子科技有限公司)；FlavourSpec?風味分析儀(德國G.A.S.)；300 mm棕色干燥器；BSA223S電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。

海參蛋白肽粉采購于大連非得生物產(chǎn)業(yè)有限公司，實驗用水均為Milli-Q純水系統(tǒng)制備的超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

稱取一組0.022 g(精確至0.001 g)海參蛋白肽粉用于DVS實驗。分別稱取1.5 g(精確至0.1 g)海參蛋白肽粉，于6瓶20 mL頂空進樣瓶中在干燥器中貯藏0、5、10、15、30、90 d備用，進行LF-NMR實驗。依次稱取0.5 g(精確至0.1 g)海參蛋白肽粉，于12瓶20 mL頂空進樣瓶中，兩兩一組作為平行對照在干燥器中貯藏0、5、10、15、30、90 d備用，進行GC-IMS實驗。

1.2.2 實驗條件

1)DVS條件

動態(tài)水分吸附分析儀RW33EBSS1/XEU，控制溫度25 ℃，總氣體流速500 mL/min，濕度范圍為0～95% RH。

2)LF-NMR條件

中心頻率(O1)為172 109.42 Hz，重復采樣等待時間(TW)為2 000 ms，信號采樣點數(shù)(TD)為60 052.00，回波時間(TE)為0.3 ms，回波個數(shù)(NECH)為1 000 個，重復掃描次數(shù)(NS)為16次。

3)自動頂空進樣單元

孵育溫度50 ℃，孵育時間40 min，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min，進樣體積500 μL，進樣針溫度85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。

4)GC條件

色譜柱類型為FS-SE-54-CB毛細管柱(15.00 m×0.53 mm×0.50 μm)，色譜柱溫度40 ℃，運行時間25 min，載氣N2純度≥99. 999%。流速：初始2 mL/min；保持2 min，流速增速至30 mL/min；保持8 min，增速至100 mL/min；保持10 min, 增速150 mL/min；保持5 min。

5)IMS條件：IMS溫度 45 ℃，載氣N2純度≥99. 999%。

1.2.3 實驗內(nèi)容

1.2.3.1 DVS實驗

參考Wang等[14]的方法進行DVS實驗。將準備好的樣品放入動態(tài)水分吸附儀樣品盤上，在動態(tài)水分吸附儀中通入恒定流量的高純氮氣，平衡至實驗溫度為25 ℃，RH為0%。樣品質(zhì)量和相對濕度等數(shù)據(jù)每隔1 min自動記錄一次，當樣品質(zhì)量變化速度連續(xù)兩次的差值小于0.002，或者平衡時間超過360 min時，則認為樣品達到吸濕平衡，強制遞增至下一級相對濕度。樣品室中0～90% RH以10 %的濕度梯度變化，90%～95% RH之間以5%梯度變化，相對濕度從最小值0上升到最大值95%再降至最小值0，完成2次循環(huán)。

1.2.3.2 LF-NMR實驗

參考Wang等[15]的方法進行LF-NMR實驗。按照實驗分組，將達到實驗時間點的樣品依次送入核磁玻璃管中運行CPMG序列，通過檢測自旋-自旋馳豫時間T2反演，利用低場核磁共振CPMG序列測量樣品，獲得T2馳豫時間分布曲線。每個樣品平行測定3次，所得數(shù)據(jù)均表示為均值±標準差(mean±SD)。采用Excel 2010軟件(Microsoft Corporation，USA)及Origin 8.5(OriginLab Corporation. MA，USA)軟件處理數(shù)據(jù)和作圖。

1.2.3.3 GC-IMS實驗

將達到實驗時間點的分別為0.5 g的2瓶海參蛋白肽粉自動進樣到色譜柱進行分離，分離完成后進入溫度為45 ℃的IMS單元，均測定2次，完成后通過軟件內(nèi)置的LAV(laboratory analytical viewer)獲得海參蛋白肽粉在干燥環(huán)境下貯藏0、5、10、15、30、90 d的特征指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于DVS方法分析海參蛋白肽粉吸濕特性

運用DVS系統(tǒng)，獲得25 ℃時的海參蛋白肽粉的水分吸附-解吸動力學曲線，如圖1A所示。右縱坐標軸為設(shè)定梯度變化的相對濕度，左縱坐標軸為已設(shè)定的不同梯度內(nèi)的海參蛋白肽粉的質(zhì)量變化，橫坐標軸為實驗時間。

從圖1A可知，在0～40% RH、80%～95% RH時，樣品質(zhì)量變化率很低，50% RH時吸濕不明顯，質(zhì)量變化率趨近于0，而在50%～60% RH的過程中，質(zhì)量變化率開始逐漸增加，70%～80% RH質(zhì)量變化率顯著增加。95% RH時質(zhì)量沒達到最大，由于還未達到其吸濕極限而繼續(xù)吸濕，在下降到90% RH時達到最大。而后隨著相對濕度梯度下降，樣品解吸，質(zhì)量減少，95%～40% RH質(zhì)量變化率較大且恒定，40%～30% RH質(zhì)量變化率達到最大，30% RH之后質(zhì)量緩慢減少直至RH為0，進入下一次循環(huán)。

圖1 海參蛋白肽粉貯藏過程中的吸濕等溫線A：吸附-解吸動力學曲線；B：吸附-解吸等溫線。Fig.1Moisture sorption isotherm of sea cucumber protein peptide powders during storageA：Adsorption-desorption kinetic curve；B：Adsorption-desorption isotherms.

圖1B橫坐標為設(shè)定梯度變化的相對濕度，縱坐標為已設(shè)定的不同梯度內(nèi)的海參蛋白肽粉的質(zhì)量變化。紅色線代表第1次吸濕過程，在0～50% RH時，樣品質(zhì)量變化率很低。在50%～95%RH時，樣品質(zhì)量變化較大，相對濕度每增加10%，樣品質(zhì)量隨之增加20%，當達到90%～95% RH時，樣品的質(zhì)量達到最大。藍色線表示樣品第1次解吸過程，隨著樣品相對濕度減小，樣品質(zhì)量減小，在相同的相對濕度下，樣品解吸時的質(zhì)量大于樣品吸濕時的質(zhì)量。第1次吸濕解吸和第2次吸濕解吸變化規(guī)律基本吻合，說明第1次吸濕解吸對第2次吸濕解吸基本無影響。

2.2 基于LF-NMR分析海參蛋白肽粉水分遷移規(guī)律

從圖2A中可以看出，隨著T2馳豫時間的增加，6組不同貯藏天數(shù)下的馳豫圖出峰時間及峰型相似。馳豫圖中有3種信號峰T21、T22、T23，分別對應3類水組分，其中峰面積越大說明氫質(zhì)子信號強度越大[16]。在馳豫圖中弛豫時間約1 ms的T21峰被認為是自由度較低的結(jié)合水，其次T22為固定化水，T23為自由水。通過對峰面積進行積分計算出水分含量。如圖2B所示，0～10 d時自由水所占比例逐漸減少，10～90 d時自由水比例逐漸增大。整體來看，各水分比例維持恒定，90 d時固定化水比例達到最小。對比圖2B與圖3A可知，自由水相對含量最少，固定化水相對含量最大。

圖2 LF-NMR弛豫時間圖及其積分柱形圖A：T2馳豫時間分布曲線；B：單位質(zhì)量總水分含量變化圖。Fig.2LF-NMR relaxation time diagram and its integral column diagramA：T2 relaxation time distribution curve；B：Chart of total moisture content per unit mass.

圖3 海參蛋白肽粉貯藏過程中的單位質(zhì)量水分變化A：海參蛋白肽粉中不同狀態(tài)單位質(zhì)量水分含量變化；B：海參蛋白肽粉的單位質(zhì)量總水分變化。Fig.3Changes of water contents per unit mass in sea cucumber protein peptide powders during storageA：Changes of water contents per unit mass in different states of sea cucumber protein peptide powders； B：Changes of total water contents per unit mass in sea cucumber protein peptide powders.

分析圖3A與圖3B可知，海參蛋白肽粉從開始貯藏到貯藏90 d后，整體單位質(zhì)量總水分明顯增加，其中在第10天達到最大值，原因可能為貯藏10 d時其具有強吸濕性，會富集干燥環(huán)境中的水分，并將自由水轉(zhuǎn)化為固定化水和結(jié)合水，使得在貯藏第10天時，單位質(zhì)量總水分最大。而后由于海參蛋白肽粉揮發(fā)解吸，總水量開始明顯下降，結(jié)合水和固定化水轉(zhuǎn)化為自由水，由于其自身的強吸濕性導致水分含量繼續(xù)增加，直至達到動態(tài)平衡趨于飽和。從圖3B中可知，海參蛋白肽粉的單位質(zhì)量總水分從0 d的(394.41±4.29)(au·ms)/g增長至90 d的(416.37±4.49)(au·ms)/g，呈明顯上升趨勢，說明其在貯藏過程中不斷吸收環(huán)境中的水分。其中，整體水分質(zhì)量在第10天達到最大值(423.15±0.18)(au·ms)/g，說明在貯藏10天左右海參蛋白肽粉的吸濕性明顯增強。

2.3 基于GC-IMS分析揮發(fā)性物質(zhì)變化規(guī)律

基于GC-IMS技術(shù)的指紋圖譜，對海參蛋白肽粉品質(zhì)的快速無損檢測提供了至關(guān)重要的理論依據(jù)。指紋圖譜直觀地反映化合物濃度的變化，通過離子遷移譜和指紋圖譜定性化合物，獲得不同貯藏時間內(nèi)具體揮發(fā)性物質(zhì)的濃度變化規(guī)律。通過確定誘導關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)的時間范圍以及某些關(guān)鍵物質(zhì)的生成時間及條件，有助于優(yōu)化貯藏條件，延長海參蛋白肽粉的貯藏時間。GC-IMS結(jié)合了分離和檢測兩方面的優(yōu)勢，可以實現(xiàn)揮發(fā)性物質(zhì)快速定性鑒定。利用分析軟件GC×IMS Library Search內(nèi)置的NIST2014數(shù)據(jù)庫對圖譜中的物質(zhì)進行定性分析，并與各色譜圖進行比對得到圖4，再將定性后的數(shù)據(jù)導入軟件LAV(laboratory analytical viewer)，通過LAV內(nèi)置的Gallery Plot插件得到圖5。

由圖4和圖5得出，1-戊醇(1_pentanol, 1-2)、2-己烯醇(2_hexenol, 5-6)、2,3-戊二酮(2_3_pentanedione, 11-12)、2-戊酮(2_Pentanone, 13-14)、2-丁酮(2_Butanone, 19-20)、2,3-丁二酮(2_3_butanedione, 21)、二甲基三硫(dimethyl-trisulfide, 25)、2-甲基丙酸(2_methylpropanoic-acid, 30)、3-甲基-1-丁醇(3_Methyl_1_butanol, 31)及2-戊酮(2_Pentanone, 32)在0 d時含量最大，隨著貯藏時間的增加，含量逐漸變小。苯甲醛(benzaldehyde, 3-4)在0 d時含量最多，5 d時含量減少，并在5～90 d內(nèi)含量保持不變。乙酸乙酯(ethyl-acetate， 17-18)在10 d時含量特異性增加，在第10天后含量下降至與0～5 d相同水平。隨著貯藏時間的延長，多數(shù)化合物濃度明顯減低，有個別化合物在貯藏10 d后生成，如10 d-2濃度增加的化合物壬醛(n-Nonanal, 22)、10 d-1濃度增加的2-甲基丙醛(2_methylpropanal, 35)，在貯藏30 d時濃度顯著增加的己酸(hexanoic acid, 24)。

3 結(jié)論

本研究通過DVS分析出海參蛋白肽粉樣品在不同濕度梯度內(nèi)的水分遷移特性，更快速地獲得海參蛋白肽粉的吸濕等溫線，指導其包裝及選擇最佳的儲藏條件，且對于確定其儲存期具有參考價值?；贚F-NMR技術(shù)建立T2馳豫時間分布曲線，得到不同貯藏時間下3種狀態(tài)水互相遷移轉(zhuǎn)換的變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)貯藏10 d左右的海參蛋白肽粉的吸濕性明顯增強，單位質(zhì)量總水分最大。結(jié)合DVS與LF-NMR來研究海參蛋白肽粉中的水分遷移規(guī)律更加深入。通過GC-IMS進行定性分析，實現(xiàn)對干燥環(huán)境下貯藏不同天數(shù)的海參蛋白肽粉品質(zhì)的快速檢測。若能結(jié)合標準物質(zhì)特征圖譜進行定量分析[17]，GC-IMS就可一步實現(xiàn)對同一品種海參蛋白肽粉的等級鑒定。通過DVS和LF-NMR技術(shù)得知，50% RH時海參蛋白肽粉吸濕不明顯，質(zhì)量變化率趨近于0，在50%～60% RH的過程中，質(zhì)量變化率開始逐漸增加，70%～80% RH質(zhì)量變化率顯著增加，說明低于50% RH有利于減弱其吸濕行為，70%～80% RH環(huán)境下的海參蛋白肽粉吸濕能力極強，不利于儲藏。經(jīng)測定，海參蛋白肽粉的整體水分質(zhì)量在第10天達到了最大值，為(423.15±0.18)(au·ms)/g，說明在貯藏10 d左右時，其吸濕性明顯增強，會富集干燥環(huán)境中的水分，并將自由水轉(zhuǎn)化為固定化水和結(jié)合水。結(jié)合基于GC-IMS技術(shù)的指紋圖譜定性出的揮發(fā)性物質(zhì)可知，在貯藏10 d后其誘導某些揮發(fā)性物質(zhì)濃度增大，如壬醛(n-Nonanal, 22)、2-甲基丙醛(2_methylpropanal, 35)及己酸(hexanoic acid, 24)。因此得出結(jié)論，在干燥環(huán)境下海參蛋白肽粉的最佳貯藏時間段應控制在10天內(nèi)，10天之后，由于海參蛋白肽粉的強吸濕性會誘導揮發(fā)物質(zhì)的產(chǎn)生，導致其營養(yǎng)價值降低。綜合以上3種技術(shù)，快速確定揮發(fā)性物質(zhì)的種類，探究出其內(nèi)部水分遷移規(guī)律，可用于預防有害物質(zhì)生成。本研究對于海參蛋白肽粉誘導其揮發(fā)性物質(zhì)的鑒別分類具有研究延展性，可避免肽粉因貯藏不當而變質(zhì)，延長其貨架期，對其品質(zhì)的快速鑒定有良好的應用前景。

圖4 海參蛋白肽粉的GC-IMS對比圖1：1-戊醇；2：1-戊醇；3：苯甲醛；4：苯甲醛；5：2_己烯醇；6：2_己烯醇；7：己醛；8：己醛；9：己醛；10：己醛；11：2,3-戊二酮；12：2,3-戊二酮； 13：2-戊酮；14：2-戊酮；15：異戊醛；16：異戊醛；17：乙酸乙酯；18：乙酸乙酯；19：2-丁酮；20：2-丁酮；21：2,3-丁二酮；22：壬醛；23：己酸； 24：己酸；25：二甲基三硫；26：庚醛；27：亞硝基-二乙基胺；28：庚醛；29：糠醛；30：異丁酸；31：異戊醇；32：2-戊酮；33：2-戊酮；34：異丁醇； 35：異丁醇；36：2-丁酮；37：甲基丙醇；38：甲基丙醇；39：異丙醇；40：異丙醇；41：乙醇。下同。Fig.4 Comparison of GC-IMS of sea cucumber protein peptide powders1： 1-pentanol; 2: 1-pentanol; 3: benzaldehyde; 4: benzaldehyde; 5: 2-hexenol; 6: 2-hexenol; 7: hexanal; 8: hexanal; 9: hexanal; 10: hexanal;11: 2-3-pentanedione;12: 2-3-pentanedione; 13: 2-pentanone; 14: 2-pentanone; 15: 3-methylbutanal; 16: 3-methylbutanal; 17: ethyl acetate;18: ethyl acetate; 19: 2-butanone; 20: 2-butanone; 21: 2-3-butanedione; 22: n-Nonanal; 23: hexanoic acid; 24: hexanoic acid;25: dimethyl trisulfide; 26: heptanal; 27: N-nitrosodiethylamine; 28: heptanal; 29: furfural; 30: 2-methylpropanoic acid; 31: 3-methyl-1-butanol;32: 2-pentanone; 33: 2-pentanone; 34: 2-methylpropanol; 35: 2-methylpropanol; 36: 2-butanone; 37: methylpropanol; 38: methylpropanol;39: 2-propanol; 40: 2-propanol; 41: ethanol. The same below.

圖5 海參蛋白肽粉的對應不同特征峰指紋圖譜Fig.5 The fingerprint of different characteristic peaks of sea cucumber protein peptide powders