董智勇，劉立芹， 龔理， 劉炳艦，江麗華，遲長鳳，呂振明*

(1.海洋生物種質(zhì)資源發(fā)掘利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江海洋大學(xué)； 2.國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江海洋大學(xué)： 浙江 舟山 316022)

曼氏無針烏賊(Sepiellajaponica)是中國重要的海洋頭足類生物，屬軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、烏賊科(Sepiidae)、無針烏賊屬(Sepiella)，是中國傳統(tǒng)的海洋漁業(yè)資源[1]。20世紀(jì)70年代，中國曼氏無針烏賊的歷史最高漁獲量僅浙江省便達(dá)6萬 t，占當(dāng)時浙江捕撈漁業(yè)總產(chǎn)量的9.3%，曼氏無針烏賊因而成為著名的東海“四大海產(chǎn)”之一[1]。但70年代末以來，由于過度捕撈和水域條件遭破壞，中國的曼氏無針烏賊漁業(yè)資源衰退嚴(yán)重，至目前已無法形成漁汛，自然資源已近枯竭[2]。為保護(hù)中國曼氏無針烏賊自然資源，國內(nèi)科研工作者開展了系列工作，并于21世紀(jì)初突破了曼氏無針烏賊的人工繁育技術(shù)瓶頸，隨后其規(guī)?；斯ぴ鲋澈唾Y源養(yǎng)護(hù)工作也在中國沿海陸續(xù)展開，并取得了初步成效[3]。但至今，中國尚未能對已堅持多年的曼氏無針烏賊增殖放流和資源養(yǎng)護(hù)工作的實際效果進(jìn)行有效評估，其根本原因是尚未形成一套有效的曼氏無針烏賊的標(biāo)志放流技術(shù)體系，因此，開展曼氏無針烏賊標(biāo)志方法的研究已迫在眉睫。

當(dāng)前，國際社會已開展了多種在海洋頭足類增殖標(biāo)志方法方面的研究。其中，體外物理標(biāo)記法、化學(xué)標(biāo)記法及電子標(biāo)簽法等傳統(tǒng)標(biāo)志技術(shù)在海洋頭足類中均有所應(yīng)用[4]。但相對而言，物理標(biāo)記法具有標(biāo)記保存率低、標(biāo)記過程易造成機體損傷等缺點；化學(xué)標(biāo)記法也存在識別困難、標(biāo)記檢測時需殺死個體等不足，在海洋頭足類方面的運用已逐漸減少[4]。而電子標(biāo)簽法具標(biāo)記容易識別、保存率高和低損傷等優(yōu)點，已逐步在海洋頭足類標(biāo)志中得到廣泛的運用[4]。如Anderson等[5]采用無源應(yīng)答器標(biāo)志法(PIT tag)在實驗室和野外條件下對郁蛸(Octopustetricus)和毛利蛸(Octopusmaorum)進(jìn)行標(biāo)志，結(jié)果表明，實驗期內(nèi)(室內(nèi)持續(xù)14個月；野外持續(xù)13個星期)兩種蛸體內(nèi)電子標(biāo)簽的保存率均為100%，且標(biāo)志后對蛸的生長和存活均無明顯影響，證明無源應(yīng)答器標(biāo)志是一種較為有效的頭足類標(biāo)記方法； Scheel等[6]采用聲吶發(fā)生器(sonar transmitter)標(biāo)志在野外條件下對40尾水蛸(Enteroctopusdofleini)進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果表明，水蛸在88 d的實驗期中對聲吶發(fā)生器標(biāo)記的保存率為83%，并可實時記錄水蛸完整的活動軌跡和遷移過程，是非常理想的頭足類標(biāo)志方法。然而，電子標(biāo)簽標(biāo)記法至今未在曼氏無針烏賊個體標(biāo)志中得到運用，僅見Jiang等[7]及董智勇等[8]采用四環(huán)素、茜素絡(luò)合物等熒光標(biāo)記法對曼氏無針烏賊進(jìn)行了標(biāo)志?；谏鲜銮闆r，本研究擬采用玻璃管動物標(biāo)簽法對曼氏無針烏賊幼體進(jìn)行標(biāo)志，研究其標(biāo)志效果及其對曼氏無針烏賊行為、生長及存活率等的影響，旨在探索建立一種適于曼氏無針烏賊的電子標(biāo)簽標(biāo)志方法，為今后曼氏無針烏賊增殖放流的效果評估及放流工藝的優(yōu)化提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

標(biāo)志用曼氏無針烏賊幼體采自浙江海洋大學(xué)校級實驗基地(東極苗種繁育中心)自培育烏賊苗種，當(dāng)幼體長至40日齡，胴長2.63～2.88 cm，體重3.47～4.69 g時，隨機挑選健康苗種220尾，用于后續(xù)的標(biāo)志實驗。標(biāo)志用玻璃管動物標(biāo)簽及配套檢測設(shè)備購于廣州洪騰條碼技術(shù)公司，標(biāo)簽型號為HT157，規(guī)格為1.5 mm×7.0 mm。

1.2 實驗方法

1.2.1 烏賊的麻醉

為避免標(biāo)志過程中烏賊幼體發(fā)生噴墨死亡，標(biāo)記前參照Wearmouth等[9]的方法將烏賊幼體進(jìn)行麻醉，具體方法是：將烏賊幼體移入50 L含1.9%的MgCl2·6H2O海水溶液中，3～5 min后烏賊即麻醉失去平衡，待烏賊完全喪失對外界刺激的反應(yīng)時即可進(jìn)行后續(xù)的標(biāo)志操作過程。

1.2.2 烏賊的標(biāo)志

將玻璃管動物標(biāo)簽及配套的注射針頭用酒精棉球消毒后，將標(biāo)簽裝入注射器針頭內(nèi)，以15°～ 45°將針頭從烏賊背部刺入內(nèi)殼包膜下，推動注射器將玻璃管動物標(biāo)簽植入內(nèi)殼包膜內(nèi)，緩慢拔出針頭，注射針孔處用酒精棉球消毒后即標(biāo)志完畢。標(biāo)志過程最好在烏賊麻醉后3～5 min內(nèi)完成，以免麻醉時間過長造成烏賊復(fù)蘇困難，共標(biāo)志烏賊幼體110尾。實驗同時設(shè)對照組，將110尾對照組烏賊麻醉，并用無標(biāo)簽的空載注射針頭扎入內(nèi)殼膜下，但無動物標(biāo)簽注入，其他操作過程同標(biāo)記組。

1.2.3 標(biāo)志后管理

將標(biāo)志好的烏賊幼體直接投入盛有清潔海水的養(yǎng)殖池中，加大養(yǎng)殖池水的氧氣充氣量，數(shù)分鐘后烏賊幼體即能逐步復(fù)蘇。將成功復(fù)蘇的104尾帶有標(biāo)簽的標(biāo)記組樣品與97尾無標(biāo)簽的對照組樣品在同等條件下進(jìn)行養(yǎng)殖，養(yǎng)殖水溫為26～28 ℃，鹽度為25～32，以鮮活野雜魚或野雜蝦為餌料進(jìn)行投喂，日投喂量為烏賊體重的20%，每日投喂2次為宜，正常進(jìn)行吸污及其他日常養(yǎng)殖管理。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

養(yǎng)殖過程中，每日記錄標(biāo)記組和對照組烏賊的死亡情況，統(tǒng)計累積死亡率，檢查標(biāo)記組的標(biāo)簽保持情況，標(biāo)簽檢測時采用肉眼觀測和標(biāo)志閱讀器讀碼自動識別相結(jié)合的方法進(jìn)行，讀碼時將標(biāo)志閱讀器靠近烏賊7～10 cm處，即可讀取烏賊體內(nèi)標(biāo)簽的編碼。同時在標(biāo)志后0、10、20、30、40和50 d(已至成體)時采集烏賊樣品，分別測量標(biāo)記組和對照組烏賊的全長、胴長、胴寬、體重、殼長、殼寬及殼重等生長性狀參數(shù)，計算瞬時生長率(IGR)，分析烏賊的生長情況，IGR=(lnw2-lnw1)/(t2-t1)×100%，其中w2和w1分別為t2日齡(d)和t1日齡(d)時的烏賊體重(g)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件比較標(biāo)記組和對照組在死亡率和生長指標(biāo)上的差異，并對差異的顯著性進(jìn)行T檢驗(Student′s t test，生長指標(biāo))和卡方檢驗(χ2，死亡率)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)志效果與保持率

將玻璃管動物標(biāo)簽(圖1A)注入曼氏無針烏賊內(nèi)殼包膜下，烏賊背部在標(biāo)簽注射部位旋即形成一突出隆起，注入初期，由于烏賊幼體皮膚較薄而透明，內(nèi)殼包膜下的玻璃管動物標(biāo)簽仍隱約可見(圖1B)。但隨著烏賊個體的生長，玻璃管動物標(biāo)簽逐步被增生的皮膚、肌肉和包膜組織掩蓋(圖1C)。標(biāo)志40 d時，烏賊體內(nèi)的玻璃管動物標(biāo)簽甚至被新形成的內(nèi)殼組織所包裹，逐步嵌入內(nèi)殼而成為內(nèi)殼中的一部分(圖1D)。即便如此，烏賊背部玻璃管動物標(biāo)簽包埋而形成的隆起仍十分清晰可見。但由于標(biāo)簽的規(guī)格和尺寸較小，在整個實驗過程中未見其對烏賊幼體行為活動產(chǎn)生明顯影響，烏賊能正常活動、攝食和生長。實驗過程中未發(fā)現(xiàn)標(biāo)記脫落的情況，實驗結(jié)束時，烏賊體內(nèi)標(biāo)簽的保持率達(dá)100%，該結(jié)果與無源應(yīng)答器標(biāo)記(PIT tags)[5,10]、檔案式標(biāo)簽(archival tags)[9]等電子標(biāo)簽標(biāo)志海洋頭足類的效果及標(biāo)記保持率相當(dāng)，且大大高于植入式熒光數(shù)字標(biāo)記(visible implant alphanumeric tags)[11]、彼得遜盤(petersen discs tags)[12]等體外物理標(biāo)志對海洋頭足類的標(biāo)記效率和保持率。標(biāo)記后的曼氏無針烏賊在靠近掃描閱讀器7～12 cm范圍內(nèi)時，可準(zhǔn)確讀取玻璃管動物標(biāo)簽的編碼。該結(jié)果表明，玻璃管動物標(biāo)簽具有標(biāo)志效果好、識別簡便及保持效率高等優(yōu)點，是一種較為理想的烏賊增殖放流標(biāo)志。

圖1 玻璃管動物標(biāo)簽法標(biāo)記曼氏無針烏賊的效果A為玻璃管動物標(biāo)簽；B為標(biāo)簽的埋植；C為標(biāo)記后的烏賊；D為內(nèi)殼膜下的動物標(biāo)簽。Fig.1The effects of tagging on Sepiella japonica juveniles with animal glass tube tagsA：animal glass tube tags used; B：the implant process of the tags; C：Sepiella japonica with tags； D：the implanted tags in the cuttlebones of Sepiella japonica.

2.2 標(biāo)志對烏賊生長發(fā)育的影響

標(biāo)志后的曼氏無針烏賊仍保持較為迅速的生長速率，50 d后即可達(dá)成體規(guī)格，瞬時生長率可達(dá)5.93%/d，該生長速率與前人測定的正常養(yǎng)殖條件下的烏賊生長速率相當(dāng)[13]。對標(biāo)記組和對照組烏賊的生長情況進(jìn)行比較，結(jié)果表明，在7個主要生長性狀參數(shù)上，除30 d時的全長、殼寬及50 d時的全長等少數(shù)指標(biāo)外，標(biāo)記組和對照組烏賊生長均無顯著性差別(P>0.05)(表1，圖2)，且標(biāo)記組和對照組曼氏無針烏賊在標(biāo)志50 d后均可達(dá)性成熟，推測所用的HT157型玻璃管動物標(biāo)簽規(guī)格較小，對標(biāo)志個體的活動、攝食等行為影響小。類似的結(jié)果也在植入式熒光數(shù)字標(biāo)記法(visible implant alphanumeric tags)標(biāo)志銀磷烏賊(Sepioteuthissepioidea)[14]、無源應(yīng)答器(PIT tags)標(biāo)記法標(biāo)志真蛸(Octopusvulgaris)[10]中有發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，從表1和圖2的數(shù)據(jù)分析，標(biāo)記組在幾乎所有生長性狀參數(shù)上均略高于對照組，盡管絕大多數(shù)未達(dá)統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性差異，但在一定程度上提示了還有必要進(jìn)一步優(yōu)化玻璃管動物標(biāo)簽的規(guī)格及埋植部位，以最大限度地降低標(biāo)志對烏賊生長發(fā)育的潛在影響。

2.3 標(biāo)志對烏賊存活率的影響

本研究還對標(biāo)記組和對照組曼氏無針烏賊存活情況進(jìn)行了為期50 d(已至成體)的跟蹤統(tǒng)計，結(jié)果表明，玻璃管動物標(biāo)簽標(biāo)志并未對烏賊的存活率產(chǎn)生明顯影響。從累積死亡率來看，50 d的養(yǎng)殖中，標(biāo)記組和對照組曼氏無針烏賊的累積死亡率分別為21.15%和17.53%，經(jīng)卡方檢驗兩者間未呈現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)(表2)，在部分時間點上，如第10天和第40天時標(biāo)記組的累積死亡率甚至低于對照組；從階段性死亡率來看，標(biāo)志后短期損傷可能較大的前期(第0～20天)的死亡率也與后期(第20～50天)的死亡率相當(dāng)，因此實驗過程中曼氏無針烏賊的死亡可能更多來源于養(yǎng)殖過程中的自然死亡，且死亡率與平洪領(lǐng)等[13]室內(nèi)養(yǎng)殖條件下獲得的曼氏無針烏賊的死亡率相當(dāng)。較高的標(biāo)志存活率在其他海洋頭足類中也多有發(fā)現(xiàn)，如Estefanell等[10]采用無源應(yīng)答器標(biāo)記法(PIT tags)標(biāo)志真蛸獲得了46.4%～100%的存活率；Anderson等[5]采用同樣的方法標(biāo)志郁蛸(Octopustetricus)和毛利蛸(Octopusmaorum)獲得了100%的存活率；前期本課題組采樣背部內(nèi)殼膜下注射茜素絡(luò)合指示劑的方法標(biāo)記曼氏無針烏賊也獲得了81.63%的較高存活率[8]。本研究采用玻璃管動物標(biāo)簽標(biāo)志曼氏無針烏賊成活率較高的原因，一方面可能是由于標(biāo)志時所用的針頭及標(biāo)簽規(guī)格較小，在注射時不會造成肌肉和皮膚大面積損傷，減少了因繼發(fā)性感染而引起的死亡；另一方面則是由于海洋頭足類本身有較強的損傷后自愈能力，Wearmouth等[9]研究了檔案式標(biāo)簽法標(biāo)志商烏賊(Sepiaoffificinalis)后的愈合能力，結(jié)果表明：標(biāo)志過程中，商烏賊背部形成的直徑2.8 mm、深5 mm的標(biāo)志位點在一個月后即完全愈合，且未出現(xiàn)任何感染跡象，可見海洋頭足類的自愈能力較強。本實驗的研究結(jié)果進(jìn)一步證實了玻璃管動物標(biāo)簽法是一種低損傷的頭足類標(biāo)志方法，在今后曼氏無針烏賊大規(guī)模標(biāo)志放流中具有較好的潛在運用價值。

表1 玻璃管動物標(biāo)簽標(biāo)記對曼氏無針烏賊生長的影響Tab.1 The effect of animal glass tube tagging on growth performance of Sepiella japonica

注：表中數(shù)據(jù)右上標(biāo)不同字母代表對照組與標(biāo)記組差異顯著(P<0.05)?！啊北硎緹o具體數(shù)據(jù)。

表2 玻璃管動物標(biāo)簽標(biāo)記對曼氏無針烏賊存活率的影響Tab. 2 The effect of animal glass tube tagging on survival rate of Sepiella japonica

圖2 玻璃管動物標(biāo)簽標(biāo)記對曼氏無針烏賊生長的影響(n=6)A：標(biāo)記對烏賊全長、胴長和胴寬的影響；B：標(biāo)記對烏賊殼長和殼寬的影響；C：標(biāo)記對烏賊體重的影響；D：標(biāo)記對烏賊殼重的影響。Fig.2 The effect of animal glass tube tagging on growth performance of Sepiella japonica(n=6)A:The effect of tagging on total length, body length and body width of Sepiella japonica; B:The effect of tagging on shell length and shell width of Sepiella japonica; C:The effect of tagging on body weight of Sepiella japonica; D:The effect of tagging on shell weight of Sepiella japonica.

3 結(jié)論

玻璃管動物標(biāo)簽法可有效應(yīng)用于曼氏無針烏賊幼體的標(biāo)志中。本研究將玻璃管動物標(biāo)簽植入曼氏無針烏賊幼體內(nèi)殼包膜下后，可在其背部標(biāo)簽所在位置形成突出的隆起，易識別，且在靠近標(biāo)簽7～12 cm范圍內(nèi)通過閱讀掃描器快速準(zhǔn)確識讀。標(biāo)志后，烏賊體內(nèi)的玻璃管動物標(biāo)簽被新形成的內(nèi)殼組織所包裹，逐步嵌入內(nèi)殼而成為內(nèi)殼中的一部分，從幼體至成體50 d內(nèi)的標(biāo)志保存率為100%。玻璃管動物標(biāo)簽標(biāo)志對烏賊的行為活動、生長和存活均無顯著性影響(P>0.05)。玻璃管動物標(biāo)簽在今后曼氏無針烏賊及其他海洋頭足類生物的大規(guī)模標(biāo)志放流中具有較大的潛在應(yīng)用價值。