歐陽德亮 劉龍飛 王麗萍 黃明明 肖建虹

(南華大學(xué)附屬第三醫(yī)院普外科，衡陽421000)

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位列惡性腫瘤的第二位。早期胃癌無明顯癥狀且易被忽略[1]。因此，大部分患者常因早期漏診而延誤最佳治療時機。盡管近年來國內(nèi)外醫(yī)療水平不斷提升，但胃癌的死亡率一直居高不下?？紤]到胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及原癌基因激活、抑癌基因失活突變等多種因素[2]，明確胃癌發(fā)生的分子機制對于臨床的診斷治療意義重大。

微小RNA(microRNA，miR) 是長約22 nt的非編碼RNA，廣泛存在于從病毒到人類的各種生物中，具有高度保守性。這些miR能夠與mRNA結(jié)合阻斷蛋白編碼基因的表達，進而影響蛋白翻譯功能。其中miR-199a-3p作為一種癌基因參與了許多人類腫瘤的發(fā)病過程，包括肝細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、卵巢癌等。研究表明，miR-199a-3p可通過下調(diào)MAPK通路來促進胃癌細(xì)胞增殖[3]。此外，miR-199a-3p還可通過抑制ZHX1表達來調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖與凋亡[4]。盡管miR-199a-3p與胃癌的發(fā)生發(fā)展存在一定的聯(lián)系，但其中的具體分子機制仍未完全明確，可能與多種靶基因的表達有關(guān)。因此，本研究旨在探討miR-199a-3p影響胃癌細(xì)胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌細(xì)胞株BCG-823、MKN-28以及正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫；CCK-8試劑購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；NET1多克隆抗體、GAPDH抗體購自Abcam公司；pcDNA3.0-miR-199a-3p、pcDNA3.0-Anti-NET1質(zhì)粒由上海基屹生物科技有限公司構(gòu)建；重組熒光素酶報告基因pISO-Net1-3′-UTR由漢恒生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 BCG-823、MKN-28和GES-1細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640，并于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將生長良好的上述細(xì)胞分別接種至24孔板中，待細(xì)胞生長至80%左右時，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別將相應(yīng)的表達質(zhì)粒以及陰性對照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，構(gòu)建出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

1.2.2CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將經(jīng)過實驗處理的BCG-823、MKN-28以及GES-1細(xì)胞以1×104ml-1細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔100 μl。分別在培養(yǎng)0、24、48、72 h后，每孔加入CCK-8溶液(5 mg/ml)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。上機檢測前，輕輕振蕩混勻1 min。隨后選擇450 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度值。

1.2.3雙熒光素酶報告基因檢測 將構(gòu)建好的pISO-NET1-3′-UTR與pISO-NET1-3′-UTR-Mut重組熒光素酶報告基因分別與miR-199a-3p、miR-199a-3p-NC以及Anti-miR、Anti-miR-NC共轉(zhuǎn)染至BCG-823細(xì)胞中，48 h后按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.2.4Western blot 檢測NET1蛋白的表達水平 提取BCG-823細(xì)胞的總蛋白。按照Western blot說明書進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜30 min。隨后滴加NET1多克隆抗體4℃孵育過夜。第2天滴加二抗后37℃孵育2 h。最后加入ECL發(fā)光液并置于顯影儀中顯影。隨后以GAPDH為內(nèi)參用Image J2X軟件進行灰度值掃描，計算相對表達量。

1.2.5qRT-PCR檢測miR-199a-3p、NET1 mRNA水平 Trizol試劑盒提取BCG-823細(xì)胞的總RNA，純化后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后按照qRT-PCR反應(yīng)體系進行引物擴增。擴增完畢后，使用2-ΔCt法計算各細(xì)胞中miR-199a-3p和NET1 mRNA的相對表達量。PCR引物設(shè)計如下：miR-199a-3p上下游引物：5′-GTCACAGTAGTCTGCACAT-3′、5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCA-3′，NET1上下游引物：5′-GTGGCTTCACCAACTATACG-3′、5′-GACTGCATTAGTTCGGATGT-3′，GAPDH上下游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.2.6流式細(xì)胞檢測 收集上述轉(zhuǎn)染后的BCG-823細(xì)胞，加入1.5 ml Hanks緩沖液。細(xì)胞過濾后置于流式管中，離心10 min棄上清液。隨后加入Binding緩沖液100 μl，振蕩混勻。再加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl的PI溶液，混勻后37℃避光孵育20 min。最后在流式管中加入150 μl Binding Buffer，上機進行流式細(xì)胞檢測。

2 結(jié)果

2.1miR-199a-3p在胃癌細(xì)胞中的表達及對其增殖的影響 通過qRT-PCR分別檢測BCG-823、MKN-28和GES-1細(xì)胞中miR-199a-3p表達水平。結(jié)果顯示，BCG-823、MKN-28細(xì)胞中miR-199a-3p水平要顯著高于GES-1細(xì)胞(P<0.01,圖1A)。而在三種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p后，BCG-823、MKN-28細(xì)胞的增殖活性在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h均顯著高于GES-1細(xì)胞(P<0.01,圖1B)。提示miR-199a-3p能夠促進胃癌細(xì)胞增殖。

2.2NET1是miR-199a-3p的靶點基因 為了明確NET1與miR-199a-3p的關(guān)系，我們進行了雙熒光素酶報告基因檢測。與共轉(zhuǎn)染miR-199a-3p-NC和NET1-3′-UTR報告基因載體相比，共轉(zhuǎn)染miR-199a-3p和NET1-3′-UTR后，熒光素酶活性顯著上升。共轉(zhuǎn)染miR-199a-3p和NET1-3′-UTR-Mut則對熒光素酶活性無顯著影響(圖2A)。而將Anti-miR、Anti-miR-NC與熒光素酶報告基因共轉(zhuǎn)染后可得到相反的結(jié)果(圖2B)，表明NET1是BCG-823細(xì)胞中miR-199a-3p的靶分子。

2.3miR-199a-3p上調(diào)人胃癌細(xì)胞中NET1蛋白的表達 Western blot結(jié)果顯示(圖3)，轉(zhuǎn)染miR-199a-3p后BCG-823細(xì)胞內(nèi)NET1蛋白的表達水平要顯著高于miR-199a-3p-NC轉(zhuǎn)染組。而轉(zhuǎn)染Anti-miR-199a-3p后NET1蛋白的表達水平則要顯著低于Anti-miR-199a轉(zhuǎn)染組。

圖1 miR-199a-3p在胃癌細(xì)胞中的表達及對其增殖的影響Fig.1 Expression of miR-199a-3p in gastric cancer cells and its effect on cell proliferationNote: A.qRT-PCR was used to detect the expression of miR-199a-3p in gastric cancer cells；B.CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation,**.P<0.01.

圖2 雙熒光素酶報告基因檢測Fig.2 Dual-luciferase reporter gene assayNote: A.Co-transfected miR-199a-3p,miR-199a-3p-NC with NET1-3′-UTR reporter vectors；B.Co-transfected Anti-miR,Anti-miR-NC with NET1-3′-UTR reporter vectors,**.P<0.01.

2.4miR-199a-3p上調(diào)人胃癌細(xì)胞中NET1 mRNA的表達 qRT-PCR進一步檢測BCG-823細(xì)胞中NET1 mRNA的表達水平。結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染miR-199a-3p表達質(zhì)粒上調(diào)BCG-823細(xì)胞中miR-199a-3p的表達水平后，NET1 mRNA表達水平顯著上升。而轉(zhuǎn)染miR-199a-3p抑制劑后，NET1 mRNA表達水平顯著降低。提示miR-199a-3p能夠促進NET1的表達。

2.5NET1對miR-199a-3p調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖的影響 BCG-823細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-199a/pcDNA、miR-199a-NC/pcDNA、miR-199a/pcDNA-Anti-NET1后，進行CCK-8細(xì)胞增殖實驗和細(xì)胞凋亡檢測。結(jié)果顯示(圖5)，miR-199a/pcDNA-Anti-NET1組的BCG-823細(xì)胞增殖水平要顯著高于miR-199a-NC/pcDNA組而低于miR-199a/pcDNA組(P<0.05)。而流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示(圖6)，miR-199a/pcDNA-Anti-NET1組的細(xì)胞凋亡率要顯著低于miR-199a-NC/pcDNA組而高于miR-199a/pcDNA組。提示miR-199a-3p可能通過上調(diào)NET1表達發(fā)揮抗凋亡以及促進細(xì)胞增殖的作用。

圖3 BCG-823細(xì)胞中NET1蛋白的表達水平Fig.3 Expression level of NET1 protein in BCG-823 cellsNote: A.Western blot was used to detect the protein expression of NET1 in BCG-823 cells；B.The relative expression of NET1 protein,**.P<0.01.

圖4 BCG-823細(xì)胞中NET1 mRNA的表達水平Fig.4 Expression level of NET1 mRNA in BCG-823 cellsNote: qRT-PCR was used to detect the expression of NET1 mRNA in BCG-823 cells,**.P<0.01.

圖5 NET1對胃癌細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effects of NET1 on proliferation of gastric cancercellsNote: CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation,*.P<0.05.

圖6 NET1對胃癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of NET1 on apoptosis of gastric cancer cellsNote: A-C.Results of flow cytometry；D.Results of apoptosis rate,**.P<0.01.

3 討論

隨著人們生活水平的提高，胃癌的發(fā)生率也呈逐年遞增趨勢，而明確其致病機制對于預(yù)防控制胃癌的發(fā)生意義重大[5]。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的單鏈RNA分子，其能夠參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化等生命活動，并直接影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。而既往研究表明，miRNA對于胃癌的發(fā)生同樣具有重要意義。miR-21水平升高能夠顯著抑制RECK的表達從而促進幽門螺桿菌感染，而下調(diào)miR-21則能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。miR-15和miR-16則與胃癌細(xì)胞耐藥的敏感性密切相關(guān)[8]。此外，有報道顯示miR-199a-3p在胃癌組織中呈高表達，其與癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度以及TNM分期均存在一定的相關(guān)性。本研究中，miR-199a-3p在胃癌細(xì)胞BCG-823、MKN-28中的水平顯著高于正常細(xì)胞，同時還能夠促進胃癌細(xì)胞增殖，這與之前的研究結(jié)論相符。

NET1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤相關(guān)基因，它與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及浸潤均存在密切關(guān)系。目前NET1已作為腫瘤基因靶向治療的關(guān)鍵分子廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的研究中[9]。NET1基因在不同鼻咽癌患者的組織中均呈現(xiàn)出特異性的高表達，提示其可作為診斷鼻咽癌發(fā)生的標(biāo)志物[10]。此外，NET1在結(jié)腸癌和膀胱癌的組織中，表達水平均要明顯高于正常人，且其表達量隨癌細(xì)胞的分化、淋巴轉(zhuǎn)移逐漸增高[11]。

目前已有報道，NET1與多種miRNA同樣存在相關(guān)性。miR-200a過表達時能夠通過誘導(dǎo)NET1表達增加來促進癌細(xì)胞的增殖與遷移[12]。miR-638則可通過靶向調(diào)節(jié)NET1表達，來減弱大腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲力[13]。而在胃癌的分子機制中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-573能夠負(fù)向調(diào)控NET1，進而抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展[14]。本研究發(fā)現(xiàn)NET1同樣是胃癌細(xì)胞中miR-199a-3p的靶分子，miR-199a-3p能夠顯著上調(diào)NET1的表達水平，該結(jié)果也進一步證實NET1與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

siRNA靶向NET1基因后，肝癌細(xì)胞增殖受到了明顯的抑制，隨后其細(xì)胞內(nèi)吞作用出現(xiàn)減弱、細(xì)胞凋亡率增加、化療藥物敏感性上升。提示NET1基因可能是腫瘤治療的潛在靶點，RNAi也可能成為腫瘤靶向治療的有效方法。而利用雙靶向siRNA技術(shù)同時沉默NET1和VEGF基因，則能夠更加顯著地抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進細(xì)胞凋亡并減少腫瘤血管的形成[15]。而本研究通過轉(zhuǎn)染Anti-NET1質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p同樣能夠通過靶向調(diào)節(jié)NET1表達，發(fā)揮抗凋亡和促進細(xì)胞增殖的作用。

綜上，miR-199a-3p參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，其在胃癌細(xì)胞中呈高表達。此外，miR-199a-3p在參與胃癌的發(fā)生過程中，可能通過上調(diào)NET1的表達發(fā)揮作用。但是考慮到腫瘤是多種因素以及不同生物過程共同作用的結(jié)果，miR-199a-3p除調(diào)控NET1外，可能還存在其他的靶點基因以及作用機制。因此，我們?nèi)孕柽M一步研究。