徐茂林 陳曉華 孫 波

(淄博市第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，淄博255200)

鼻咽癌是我國廣州等南方地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，因其主要定位于鼻咽腔頂部和側(cè)壁，放療成為了其最主要的治療手段[1]。隨著放療技術(shù)及方案的改進(jìn)，患者的生存率有了明顯提高，但隨著治療的進(jìn)展，部分患者對(duì)放射治療出現(xiàn)抵抗，最終導(dǎo)致治療失敗[2,3]。生物細(xì)胞對(duì)電離輻射的反應(yīng)性受多種因素影響，其中，乏氧細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡調(diào)控是關(guān)鍵因素[4]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，參與了腫瘤進(jìn)展、血管生成等多個(gè)環(huán)節(jié)[5]。生存素(Survivin)是一種高效能的凋亡抑制因子，可通過抑制Caspase 活性而發(fā)揮作用[6]。有研究表明，HIF-1α、Survivin的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)，但機(jī)制尚不明確。

1 材料與方法

1.1材料 鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2購于武漢博士德生物科技公司。質(zhì)粒大提試劑、DH5et大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購于美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購于TaKaRa公司(大連)，miRNA干擾質(zhì)粒由武漢博士德生物科技公司合成構(gòu)建。兔抗人HIF-1α單克隆抗體、兔抗人Survivin單克隆抗體購于Abcam公司(英國)。35只4～6周齡BALB/C-nu/nu雌性裸鼠，購自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 細(xì)胞CNE-2在37℃，5%CO2條件恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代1次。制備CNE-2單細(xì)胞懸液，接種，貼壁培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染，6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下計(jì)算轉(zhuǎn)染率；根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同，將CNE-2細(xì)胞分為HIF-1α干擾組、Survivin干擾組、聯(lián)合干擾組、空載組及陰性對(duì)照組。

1.2.2小鼠移植瘤模型構(gòu)建及X射線照射 將35只裸鼠隨機(jī)均分為5組，在右腋皮下注射CNE-2細(xì)胞(0.2 ml，1.5×1010L-1)，密切觀察裸鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)狀況及成瘤情況等。在成瘤3 d時(shí)，各組隨機(jī)選取5只裸鼠進(jìn)行放射治療，5 Gy/次，共15 Gy，每隔3 d進(jìn)行一次。裸鼠在放射治療結(jié)束后3 d處死，測量腫瘤體積，計(jì)算5只裸鼠的平均腫瘤體積。

1.2.3HIF-1α和Survivin mRNA表達(dá)水平 ①組織中總RNA提?。簶?biāo)本組織用PBS清洗研磨后，滴加1 ml Trizol，收集裂解物。加入氯仿0.2 ml，離心后吸取上清至EP管，加入異丙醇，混勻后靜置10 min。再次離心后棄上清，取管底沉淀，加入乙醇，再次離心，保留沉淀，靜置后加入DEPC水至完全溶解。采用紫外分光光度儀測定RNA濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)RNA濃度計(jì)算需加入的RNA體積，加入OligodT 1 μl，DEPC水，總體積13 μl。反應(yīng)加樣體系包括，Buffer 4.0 μl，RNA酶抑制劑 0.5 μl，dNTP 2.0 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，Total2以上體系混勻后，離心，所得cDNA置于-20℃下保存。③RT-PCR檢測：以cDNA為模板，嚴(yán)格按照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系包括：SYBRPremixExTapTMⅡ(2×)10.0 μl、PCR Forward Primer (10 μl) 1.0 μl、PCR Reverse Primer (10 μl) 1.0 μl、DNA模板(<100 ng)1.0 μl、dH2O 7.0 μl。反應(yīng)條件為，95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s、60℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.4HIF-1α和Survivin 蛋白表達(dá)水平及凋亡細(xì)胞檢測 取裸鼠瘤體組織提取總蛋白。取25 μg上樣，采用SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，滴加一抗，HIF-1α單抗(1∶2 000)、Survivin單克隆抗體(1∶5 000)，4℃孵育過夜，滴加二抗。以GAPDH為內(nèi)參，溫室孵育，TBST洗滌，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光，以Image J圖像分析系統(tǒng)測定條帶灰度值。移植瘤凋亡細(xì)胞采用TUNEL法檢測。瘤體常規(guī)脫水，包埋，切片。染色過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。攝片后，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。陽性標(biāo)準(zhǔn)：胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒。

2 結(jié)果

2.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率及基因沉默效率 轉(zhuǎn)染48 h后，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率高于90%，熒光細(xì)胞數(shù)量大于90%。RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIF-1α、Survivin基因的沉默率均高于85%，可用于構(gòu)建裸鼠腫瘤模型。見圖1。

2.2裸鼠皮下移植瘤及放射治療效果 各組CNE-2細(xì)胞均能在裸鼠體內(nèi)良好成瘤，成瘤率100%(35/35)。第3天，陰性對(duì)照組及空載組腫塊出現(xiàn)，且直徑明顯大于其他組；第4天，兩基因干擾組出現(xiàn)腫塊；第6天，聯(lián)合干擾組出現(xiàn)腫塊。生長曲線顯示，隨著成瘤時(shí)間的延長，空載組、陰性對(duì)照組裸鼠的腫瘤生長速度明顯更快，腫瘤體積顯著更大，其他三組的體積變化率顯著較低。見表1、圖2。

圖1 轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后CNE-2細(xì)胞的熒光染色結(jié)果(×100)Fig.1 Fluorescence staining of CNE-2 cells after trans-fection of interfering plasmids(×100)

表1 各組裸鼠皮下移植瘤體積(mm3)

Tab.1 Subcutaneous tumor volume of nude mice(mm3)

TimeHIF-1α interfere groupSurvivin interfere groupJoint interfere groupBlank load transfection groupNegative group6 d59.13±13.1852.79±14.1647.68±12.33203.84±32.87294.62±49.119 d89.25±19.7287.12±18.4753.46±13.98317.28±66.14471.68±54.9712 d93.14±18.4491.28±16.5757.92±14.13476.17±187.68663.56±131.4615 d113.94±17.28119.84±16.7564.86±15.26589.73±174.13819.46±146.9818 d149.39±26.47146.28±19.7686.17±13.45813.59±186.171 094.14±199.34

表2 HIF-1α和Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量

Tab.2 Relative expression of HIF-1α and Survivin mRNA

GroupsHIF-1αSurvivinHIF-1α interfere group26.9±3.6-Survivin interfere group-24.5±3.1Joint interfere group18.6±2.113.5±4.5Blank load transfection group93.9±12.491.7±9.3Negative group100.0±10.2100.0±11.4

表3 HIF-1α和Survivin蛋白表達(dá)水平

Tab.3 Expression of HIF-1α and Survivin

GroupsHIF-1αSurvivinHIF-1α interfere group69.7±11.6-Survivin interfere group-46.6±5.0Joint interfere group61.9±9.039.7±7.0Blank load transfection group97.7±12.091.3±13.7Negative group100.0±13.0100.0±9.0

圖2 裸鼠皮下移植瘤體積Fig.2 Volume of subcutaneous transplanted tumors in nude miceNote: A.HIF-1α interfere group；B.Survivin interfere group；C.Joint interfere group;D.Blank load transfection group；E.Negative group.

2.3RT-qPCR檢測 基因的融解曲線均為單峰，無其他雜峰信號(hào)，檢測結(jié)果可靠，擴(kuò)增曲線平滑，呈S型。轉(zhuǎn)染后基因沉默效應(yīng)較好，各組裸鼠組織中HIF-1α和Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量見表2。HIF-1α干擾組、Survivin干擾組、聯(lián)合干擾組的HIF-1α、Survivin的基因沉默率均高于85%。見圖3、表2。

圖3 融解曲線(A)和擴(kuò)增曲線(B)Fig.3 Melting curve (A) and amplification curve (B)

2.4Western blot檢測 各組裸鼠組織中HIF-1α、Survivin蛋白表達(dá)量見表3。根據(jù)公式，蛋白沉默效率=1-實(shí)驗(yàn)組蛋白相對(duì)表達(dá)量/對(duì)照組蛋白相對(duì)表達(dá)量，陰性對(duì)照組與空載組的蛋白表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，HIF-1α干擾組、Survivin干擾組、聯(lián)合干擾組的表達(dá)量均顯著小于對(duì)照組及空載組(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 HIF-1α蛋白、Survivin蛋白在組織中的表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of HIF-1α protein and Survivin protein in tissuesNote: A.Negative group；B.Blank load transfection group；C.HIF-1α interfere group；D.Joint interfere group；E.Survivin interfere group.

2.5沉默基因聯(lián)合X射線照射對(duì)鼻咽癌裸鼠移植瘤凋亡的影響 TUNEL檢測結(jié)果顯示，正常細(xì)胞胞核藍(lán)染，形態(tài)均一，無黃染顆粒。凋亡細(xì)胞胞核固縮，形態(tài)異常，出現(xiàn)棕黃色顆粒。HIF-1α干擾組、Survivin干擾組、聯(lián)合干擾組之間，兩兩比較，凋亡細(xì)胞數(shù)量無明顯差異(P>0.05)。但三組的凋亡細(xì)胞數(shù)量均明顯多于空載組、陰性對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論

鼻咽癌屬于放射治療中度敏感腫瘤，放療仍然是首選治療手段[7]。我國幅員遼闊，人們食物譜及生活環(huán)境、生活習(xí)慣不盡相同，不同地區(qū)之間鼻咽癌的發(fā)病率和死亡率差距相對(duì)較大[8,9]。近年來，隨著基因組學(xué)、分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，腫瘤的基因治療理論逐漸成熟并日趨完善。目前，腫瘤的基因治療的研究主要集中于基因沉默治療、自殺基因療法、腫瘤多藥耐藥基因治療、抗端粒酶療法等方面[10]。

腫瘤細(xì)胞代謝率顯著高于正常組織，實(shí)體腫瘤及微環(huán)境均處于缺血缺氧狀態(tài)。HIF-1α的主要功能之一就是維持腫瘤細(xì)胞在乏氧環(huán)境中生存，在乳腺癌、胃癌、肺癌等多種實(shí)體惡性腫瘤中，均有HIF-1α蛋白的異常表達(dá)[11]。Survivin則廣泛參與了細(xì)胞有絲分裂、凋亡及血管生成的調(diào)控過程[12]。在本研究中，隨著成瘤時(shí)間的延長，空載組、陰性對(duì)照組裸鼠的腫瘤生長速度明顯更快，腫瘤體積顯著更大，其他三組的體積變化率顯著較低。這表明沉默HIF-1α、Survivin基因能明顯減緩移植瘤生長速度。同時(shí)，對(duì)照組及空載組的mRNA表達(dá)量、蛋白表達(dá)量也明顯高于其他組，且凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著更多。這提示沉默HIF-1α、Survivin基因可提高移植瘤對(duì)放射線的敏感性。夏天等[13]在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，沉默HIF-1α基因可有效促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。李潔清等[14]在裸鼠肺癌模型中也發(fā)現(xiàn)的同樣的現(xiàn)象，抑制HIF-1α基因后，肺癌移植瘤生長速度明顯放緩，放射治療效果也更加明顯。這都顯示了HIF-1α表達(dá)在腫瘤放療抵抗的重要意義，隨著其機(jī)制研究的不斷透徹，HIF-1α成為今后臨床上基因分子治療提高放療敏感性的潛在基因靶點(diǎn)。

為了進(jìn)一步探討兩種基因的表達(dá)之間是否存在協(xié)同關(guān)系，本研究設(shè)置了聯(lián)合干擾組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，比單一干擾組相比，雖然聯(lián)合干擾組的抑瘤效率相對(duì)更高、凋亡細(xì)胞數(shù)也更多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與部分研究者的結(jié)論不完全一致。任艷鑫等[15]將以HIF、Survivin基因?yàn)榘袠?biāo)的siRNA轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞增殖能力明顯下降，靶基因的mRNA、蛋白的表達(dá)水平也明顯降低，聯(lián)合轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的所有檢測結(jié)果均顯著強(qiáng)于對(duì)照組。目前，關(guān)于聯(lián)合干擾HIF-1α及Survivin 基因的文獻(xiàn)較少，具體機(jī)制也不明確?；虻恼{(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，二者之間、二者與其他基因之間必定還存在許多或正或負(fù)的相互關(guān)系。本研究只是單純敲除兩個(gè)基因，可能并不能體現(xiàn)兩者之間復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，對(duì)二者的關(guān)系研究尚不夠深入。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的HIF-1α、Survivin基因干擾能有效增強(qiáng)鼻咽癌移植瘤裸鼠模型對(duì)放療的敏感性，但聯(lián)合干擾后敏感性未明顯增強(qiáng)。