章海通，邢家溧，2，*，傅曉，王紹輝，承海，周霞霞，吳瑩瑩，陳燦燦

（1.寧波市食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江寧波315048；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211）

金黃色葡萄球菌（Staphlococcus aureus，SA）是一種常見的病原菌，為葡萄球菌屬，革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，廣泛存在于自然界、健康人體的皮膚和咽喉部等，易引起食品污染，是一種重要的食源性病原菌[1]。該菌在適宜的基質(zhì)和環(huán)境條件下可產(chǎn)生腸毒素-葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxin，SE），是該菌分泌的外毒素，為一組可溶性單鏈蛋白，在結(jié)構(gòu)和功能上有一定相似性。根據(jù)SE 的抗原性可將其分為5 個(gè)經(jīng)典的血清型，分別為：SEA、SEB、SEC、SED 和 SEE 5 種類型[2]，近些年也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他類型的腸毒素[3]。金黃色葡萄球菌引起食物中毒的主要癥狀為嘔吐和腹瀉，鑒于腸毒素是其主要致病因子，因此開展腸毒素檢測(cè)和分型工作對(duì)鑒別金黃色葡萄球菌引起的食物中毒有重要意義。

另一方面，當(dāng)發(fā)生金黃色葡萄球菌引起的食物中毒時(shí)，突發(fā)的食物中毒事件往往在實(shí)驗(yàn)室藥敏試驗(yàn)之前就已經(jīng)給患者給藥，臨床上首選是用抗生素治療。而細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)容易導(dǎo)致錯(cuò)誤的藥物使用。那么食源性致病菌耐藥性與臨床治療相關(guān)病癥的關(guān)聯(lián)性引起了關(guān)注[4]。

由于抗生素在禽畜、畜牧養(yǎng)殖行業(yè)的不合理使用導(dǎo)致抗生素殘留問題在相關(guān)食品中出現(xiàn)，從而使食源性金黃色葡萄球菌的耐藥性不斷增多，食源性細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)逐漸成為令人關(guān)注的公共食品衛(wèi)生和安全問題[5-6]。通過全自動(dòng)熒光酶聯(lián)免疫法對(duì)從食品中分離得到的金黃色葡萄球菌進(jìn)行腸毒素總量檢測(cè)，并采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法對(duì)產(chǎn)腸毒素的菌株進(jìn)行腸毒素分型，獲得相關(guān)的腸毒素血清型分布狀況，再將分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，分析其耐藥譜。了解日常檢測(cè)分離株產(chǎn)腸毒素和耐藥情況，探討食源性金黃色葡萄球菌所產(chǎn)毒素的類型及分布狀況，研究其耐藥特性，為相關(guān)的監(jiān)測(cè)和預(yù)警提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

2016～2017年間共采集5 類食品（包括散裝熟肉、餐飲食品、米面制品、蛋制品、蔬菜及其制品）及食物中毒樣共計(jì)370 份。其中散裝熟肉采自熟食店，餐飲食品采自中式快餐店，米面制品來自食品加工廠，蛋制品和蔬菜及其制品均為市售。質(zhì)控對(duì)照菌株為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株金黃色葡萄球菌（ATCC25923）。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、血瓊脂平板：北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司；VIDAS 葡萄球菌腸毒素檢測(cè)試劑盒：法國生物梅里埃；金黃色葡萄球菌腸毒素分型試劑盒：德國拜發(fā)公司；革蘭氏陽性菌鑒定藥敏板條：美國BD 公司。

1.3 主要儀器

IF750 恒溫培養(yǎng)箱：德國 memmert 公司；mini-VIDAS 全自動(dòng)熒光酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：法國生物梅里埃公司；1378 二級(jí)生物安全柜、902 超低溫冰箱、MK3 酶標(biāo)儀：美國 Thermo Fisher 公司；Phoenix M50 全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)：美國BD 公司。

1.4 試驗(yàn)與方法

1.4.1 目標(biāo)菌分離鑒定

所有樣品按照GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》增菌分離、鑒定[7]。然后利用Phoenix M50 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行確認(rèn)，將結(jié)果為金黃色葡萄球菌的菌株，-70 ℃磁珠保藏。

1.4.2 腸毒素總量檢測(cè)

將保存于磁珠的29 株金黃色葡萄球菌分離株，接種于血平板36 ℃培養(yǎng)18 h，再分別挑取單個(gè)菌落接種于BHI 36 ℃過夜培養(yǎng)。然后吸取上述培養(yǎng)液1 mL 放入1.5 mL 無菌離心管，4 500 g 離心5 min，取上清液無菌過濾，吸取濾液0.5 mL 加入葡萄球菌腸毒素檢測(cè)試劑條中，按全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)操作規(guī)程上機(jī)檢測(cè)。每株菌株重復(fù)3 次試驗(yàn)。

1.4.3 腸毒素分型

將1.4.2 腸毒素檢測(cè)結(jié)果為陽性的菌株，再次接種于BHI 36 ℃過夜培養(yǎng)。吸取上述培養(yǎng)液1 mL 放入1.5 mL 無菌離心管，4 500 g 離心5 min，取上清液無菌過濾。通過腸毒素分型試劑盒對(duì)腸毒素A～E 進(jìn)行分型。每株菌株重復(fù)3 次試驗(yàn)。

1.4.4 金黃色葡萄球菌耐藥性試驗(yàn)

利用全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)（Phoenix M50）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。用接種培養(yǎng)液配制0.5 麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，在藥敏試?yàn)肉湯中垂直滴加一滴藥敏指示劑，從接種培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移25 μL 菌懸液至藥敏試驗(yàn)肉湯，顛倒混勻，將接種培養(yǎng)液和藥敏試驗(yàn)肉湯分別傾倒入鑒定/藥敏板，用密封條將鑒定/藥敏板封好，掃描鑒定/藥敏板條形碼，上機(jī)試驗(yàn)。每株菌株重復(fù)3 次試驗(yàn)。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 和SPSS 16.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件處理分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌檢出率及產(chǎn)腸毒素情況

不同來源食品金黃色葡萄球菌檢出率及腸毒素陽性情況如表1 所示。

表1 不同來源食品金黃色葡萄球菌檢出率及腸毒素陽性情況Table 1 Detection rate of Staphylococcus aureus and enterotoxin positive from different sources

在5 類食品及食物中毒樣共370 份樣品中分離得到29 株金黃色葡萄球菌，通過腸毒素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)腸毒素的有16 株，產(chǎn)腸毒素率為55.2%，這表明并不是所有被金黃色葡萄球菌污染的食品都會(huì)產(chǎn)腸毒素，而腸毒素是該菌引起的食物中毒的直接原因，有研究表明，95%的金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，都是由SEA～SEE 這5 種腸毒素導(dǎo)致的[8]。其中從食物中毒樣品中分離的5 株都為腸毒素陽性，腸毒素陽性率為100%。

雖然熱處理可殺死金黃色葡萄球菌，但腸毒素對(duì)熱穩(wěn)定，在高溫下仍能保持活性[9]。從表1 的試驗(yàn)結(jié)果可知，食物中毒樣品分離的菌株都能檢出腸毒素，這與臨床表現(xiàn)相符，且與沈玄藝等[10]研究結(jié)果一致。試驗(yàn)結(jié)果顯示，常規(guī)食品分離株腸毒素陽性率較高，達(dá)到55.2 %，由表1 可見，散裝熟肉腸毒素的檢出率為57.1%，餐飲食品的腸毒素的檢出率為62.5%，高于米面制品（20.0%）和蔬菜的檢出率（33.3%），這與蘇靜等[11]的報(bào)道相符，這些食品在食品安全監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中予以重點(diǎn)關(guān)注。

2.2 金黃色葡萄球菌腸毒素分型結(jié)果

腸毒素分型結(jié)果如表2 所示。

分型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)2 種及以上腸毒素的菌株為12株，占41.4%。A 型～E 型常見腸毒素都有檢出，產(chǎn)SEE的菌株最多，有12 株，占41.4%，產(chǎn)SEA 的菌株次之，有11 株，占39.3%。其中16 株腸毒素陽性的菌株中有12 株菌產(chǎn)至少2 種腸毒素，占比達(dá)到75.0%，菌株產(chǎn)腸毒素的種類越多，引起食物中毒的風(fēng)險(xiǎn)也越大，相對(duì)應(yīng)的臨床表現(xiàn)越嚴(yán)重，危害越大。

表2 食品分離株腸毒素分型結(jié)果Table 2 Typing results of enterotoxin in food isolates

2.3 金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將食品中分離到的29 株金黃色葡萄球菌用20 種不同的抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表3 和表4。

表3 食品分離菌株對(duì)20 種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of drug sensitivity test of food isolates to 20 antibiotics

表4 金黃色葡萄球菌耐藥普Table 4 Staphylococcus aureus resistance

菌株對(duì)慶大霉素（gentamicin，GM）、妥布霉素（tobramycin，NN）、青霉素（penicillin，P）、安芐西林（ampicillin，AM）、苯唑西林（oxacillin，OX）、阿莫西林-克拉維酸（amoxicillin-clavulanic acid，AMC）、復(fù)方新諾名（paediatric compound sulfamethoxazole tablets，SXT）、克林霉素（clindamycin，CC）、紅霉素（erythromycin，E）、利福平（rifampicin，RA）、四環(huán)素（tetracycline，TE）均有不同程度的耐藥性，耐藥率分別為6.9%、13.8%、82.8%、8.2.8%、10.3%、10.3%、10.3%、20.7%、44.8%、6.9%、17.2%。分離菌株除了4 株全部都敏感外，其他25 株都有不同程度的耐藥，整體耐藥率為86.2%，并發(fā)現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。

細(xì)菌的耐藥性在臨床研究較多，對(duì)于食源性致病菌耐藥性的關(guān)注相對(duì)較少。近些年，抗生素在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的廣泛使用，食源性細(xì)菌的抗藥性出現(xiàn)且呈上升的趨勢(shì)，對(duì)人體健康威脅不斷增大。細(xì)菌的耐藥性通過動(dòng)物源性的食物鏈傳播給人類并成為人類病原菌耐藥重要原因，抗菌藥物的使用還影響人體內(nèi)的微生態(tài)及其生存環(huán)境[12]。藥敏試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除對(duì)阿米卡星（amikacin，AN）、甲氧芐氨嘧啶（trimethoprim，TMP）、替考拉寧 （teicoplanin，TEC）、萬古霉素（vancomycin，VA）、奎奴普丁/達(dá)富普丁的復(fù)合制劑（synercid，SYN）、利奈唑烷（linezolid，LZD）、莫匹羅星-HL（mopirocin-HL，MUH）、呋喃妥因 （furadantin，F(xiàn)M）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）9 種抗菌藥物敏感外，其余 11 種均有不同程度的耐藥，尤其是青霉素和安芐西林與2001年中國耐藥監(jiān)測(cè)研究組對(duì)全國98 株臨床金黃色葡萄球菌的耐藥結(jié)果83.67%基本一致[13]，兩者結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無顯著差異（P＞0.05），說明食源性金黃色葡萄球菌耐藥性與臨床菌株耐藥性高度相關(guān)。

臨床上萬古霉素（VA）是治療感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的金標(biāo)準(zhǔn)，本次試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)有耐萬古霉素（VA）的菌株，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。對(duì)單種抗生素的耐藥率由高到低依次為青霉素（P）82.8%、安芐西林（AM）82.8%、紅霉素（E）44.8%、克林霉素（CC）20.7%、四環(huán)素（TE）17.2%、妥布霉素（NN）13.8%、苯唑西林（OX）10.3%、阿莫西林-克拉維酸（AMC）10.3%、復(fù)方新諾名（SXT）10.3%、慶大霉素（GM）6.9%、利福平（RA）6.9%。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有多重耐藥現(xiàn)象，同時(shí)對(duì)2 種抗生素耐藥的菌株為8 株，占27.6%，三重耐藥菌株也是8 株，占比27.6%，3 株菌對(duì)4 種抗菌藥物都耐藥，各有一株金黃色葡萄球菌分別對(duì)5 種和6 種抗菌藥物耐藥，耐藥情況最嚴(yán)重的3 株菌同時(shí)對(duì)8 種抗菌藥物耐藥，占比為10.3%。多重耐藥金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)，預(yù)示著食用由這類菌污染的食品帶來更大的安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)為臨床給藥和治療帶來更大的挑戰(zhàn)。食源性金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性主要是動(dòng)物飼養(yǎng)過程中使用抗生素導(dǎo)致食源性耐藥菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散，且在食品中的藥物殘留可能干擾人腸道內(nèi)的正常菌叢和誘導(dǎo)臨床耐藥病原菌株，動(dòng)物排泄物中的抗生素和耐藥菌排入環(huán)境并長期保持耐藥性質(zhì)[15]。因此應(yīng)加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)，在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)加大宣傳力度，減少抗生素濫用，從源頭上控制細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)。

3 結(jié)論

本文通過對(duì)5 類食品（包括散裝熟肉、餐飲食品、米面制品、蛋制品、蔬菜及其制品）及食物中毒樣共計(jì)370 份樣品分離得到的29 株金黃色葡萄球菌進(jìn)行腸毒素分析與分型研究，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)腸毒素的有16 株，產(chǎn)腸毒素率為55.2%，其中熟肉制品和餐飲食品更容易受到金黃色葡萄球菌及其腸毒素的污染；通過分型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)SEE 的菌株最多，有12 株，占41.4%，產(chǎn)SEA的菌株次之，有11 株，占39.3%。其中16 株腸毒素陽性的菌株中有12 株菌產(chǎn)至少2 種腸毒素，占比達(dá)到75.0%。現(xiàn)行的食品致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)金黃色葡萄球菌有一個(gè)安全限量指標(biāo)，低于這個(gè)指標(biāo)即被認(rèn)為可接受。實(shí)際情況是少量的產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌污染了相關(guān)食品，這些腸毒素陽性株在適宜的條件下大量繁殖，進(jìn)而產(chǎn)生大量的腸毒素，最終也會(huì)引起食物中毒事件的發(fā)生。由此對(duì)食品中分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行腸毒素檢測(cè)和分型分析有較高的現(xiàn)實(shí)意義。

考慮到食源性致病菌耐藥性與臨床治療相關(guān)病癥的關(guān)聯(lián)性，對(duì)29 株食源性金黃色葡萄球菌對(duì)慶大霉素（GM）、妥布霉素（NN）、青霉素（P）、安芐西林（AM）、苯唑西林（OX）、阿莫西林-克拉維酸（AMC）、復(fù)方新諾名（SXT）、克林霉素（CC）、紅霉素（E）、利福平（RA）、四環(huán)素（TE）耐藥性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均有不同程度的耐藥性并出現(xiàn)多重耐藥性，其中對(duì)青霉素（P）和安芐西林（AM）的耐藥率最高，均為82.8%，其次為紅霉素（E）44.8%。此次研究發(fā)現(xiàn)食源性分離株對(duì)多種抗生素存在不同程度的耐藥性和多重耐藥現(xiàn)象，建議在藥物使用源頭上加強(qiáng)宣傳和控制，降低因細(xì)菌耐藥而引起的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。金黃色葡萄球菌的腸毒素產(chǎn)毒機(jī)理以及耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。