謝佩吾 曾慶團(tuán) 白青松 陳一群 陳杰連 連輝明 何波祥 張 謙

( 1. 廣東省林業(yè)科學(xué)研究院廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510520；2. 廣東省天井山林場(chǎng)，廣東 韶關(guān) 512726)

互葉白千層（Melaleuca alternifolia），又名茶樹，原產(chǎn)于澳大利亞新南威爾士和昆士蘭，是桃金娘科（Myrtaceae）多年生木本植物[1-2]。因其葉片所含萜烯物質(zhì)的不同，共分為6種化學(xué)型，其中3種為典型類型：4-松油醇型、1,8-桉葉油素型和異松油烯型，另外3種為雜合中間類型[2-3]。4-松油醇型精油價(jià)值最高，且3年生后每年可采收枝葉提取精油，開發(fā)潛力最大[4]。研究顯示，4-松油醇型茶樹油具有顯著的抗真菌和抗細(xì)菌功效，并且對(duì)皮膚腫瘤具有明顯抑制作用，已廣泛用于生產(chǎn)個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品，并在室內(nèi)清潔、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療等方面開發(fā)了系列產(chǎn)品[5-6]。

互葉白千層種源與單株間的精油含量和品質(zhì)存在顯著差異[7]，選育葉片中4-松油醇含量高且1,8-桉葉油素和檸檬烯含量低的品系，是當(dāng)前育種工作的主要目標(biāo)[2]。澳大利亞于1993年啟動(dòng)了互葉白千層良種選育研究，歷經(jīng)4輪選育，將精油產(chǎn)量由最初的148 kg/hm2提高到250 kg/hm2[4,8]。精油中4-松油醇占比穩(wěn)定在35.0%以上，最高可達(dá)48.0%，1,8-桉葉油素占比控制在10.0%以內(nèi)，檸檬烯含量保持在安全水平的0.5%～1.5%[9]。

我國于20世紀(jì)90年開始互葉白千層引種試驗(yàn)，目前已在廣東、廣西、福建等地建立了規(guī)模化種植基地，引種資源生長(zhǎng)性狀以及精油產(chǎn)量與品質(zhì)多呈現(xiàn)出良好的適應(yīng)性[10-12]。鑒于種植苗木多為澳大利亞引進(jìn)的商業(yè)化種子苗，其種質(zhì)資源遺傳背景與遺傳豐富度不清晰，用于良種選育的潛力不明確，加上我國對(duì)互葉白千層選育研究的投入長(zhǎng)期不足，致使我國在新種質(zhì)創(chuàng)制研究領(lǐng)域遠(yuǎn)落后于澳大利亞。近年來，受澳大利亞優(yōu)質(zhì)資源出口限制，我國互葉白千層種質(zhì)資源面臨掣肘，林地經(jīng)濟(jì)效益不能實(shí)現(xiàn)最大化，嚴(yán)重阻礙了我國茶樹油產(chǎn)業(yè)發(fā)展，迫切需要系統(tǒng)開展良種選育研究，培育一批具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)異新品系，沖破國外對(duì)優(yōu)質(zhì)資源的壟斷和限制。為此，本研究以從澳大利亞引進(jìn)的4-松油醇型互葉白千層種子園混合子代為材料，系統(tǒng)開展生長(zhǎng)性狀、精油含量與有效成分的精準(zhǔn)分析，從中篩選出一批表型優(yōu)異的單株，為今后新種質(zhì)創(chuàng)制研究?jī)?chǔ)備戰(zhàn)略遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2012年12月從澳大利亞茶樹油產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)（ATTIA）引進(jìn)的一批4-松油醇型互葉白千層種子園混合種子[4]，并于2013年2月人工播種育苗，共計(jì)繁育苗木10萬株。2014年3月，采用隨機(jī)混交種植的方式，在廣東省韶關(guān)市乳源瑤族自治縣太陽鎮(zhèn)營(yíng)建互葉白千層人工林，種植密度為6 000株/hm2，最終建成互葉白千層的粵北資源林。試驗(yàn)地海拔280～410 m，地勢(shì)較平坦，坡度小于3°。土壤為花崗巖風(fēng)化的紅壤，土層厚超過90 cm，腐殖土超過12 cm。年平均氣溫15.8 °C，年降雨量1 170.5 mm，年日照時(shí)數(shù)為2 002 h。

1.2 待測(cè)單株選擇

鑒于試驗(yàn)林譜系不清晰，課題組模仿天然林選優(yōu)的方法[13-14]，于2017年12月采用隨機(jī)選擇的方式，在4年生試驗(yàn)林中選擇立地條件基本一致的區(qū)域挑選211株待測(cè)單株。為了提高選擇群體的遺傳豐富度，兩兩入選單株之間的距離不小于25 m。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 單株生物量測(cè)定

選定待測(cè)單株后，測(cè)定樹高（m）、胸徑（cm）、縱向和橫向冠層寬（m），并依據(jù)縱向和橫向冠層寬計(jì)算樹冠截面積（m2），計(jì)算公式為：

1.3.2 單株精油提煉

在待測(cè)單株樹冠西側(cè)向下1/2處采集同等成熟度的枝葉，用塑料袋密封后帶回實(shí)驗(yàn)室，4 °C冰箱保存。鮮葉精油提煉采用隔水蒸餾法[15]。首先將采集的枝葉進(jìn)行分揀，剔除直徑2 mm以上的枝條，保留新鮮葉片，精準(zhǔn)稱量700 g，裝入10 L自制圓柱狀蒸餾鋼瓶，鮮葉與鋼瓶底部保留2 L隔離區(qū)，滿足隔水蒸餾鮮葉精油的需要；隨后在蒸餾鋼瓶上安裝揮發(fā)油測(cè)定器和冷凝管，加熱蒸餾到揮發(fā)油不再增加時(shí)，停止加熱，冷卻到室溫；最后分離精油，稱量并計(jì)算鮮葉含油量（g/kg）。

與警察高校而言，獨(dú)立設(shè)課后的實(shí)驗(yàn)教學(xué)學(xué)時(shí)數(shù)應(yīng)有理有據(jù)，合理安排，尤其如犯罪現(xiàn)場(chǎng)勘查、痕跡檢驗(yàn)、交通事故處置等實(shí)踐應(yīng)用性強(qiáng)的專業(yè)課程，其實(shí)驗(yàn)教學(xué)學(xué)時(shí)應(yīng)調(diào)整為原總學(xué)時(shí)（原課堂理論教學(xué)學(xué)時(shí)與原教學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)之和）的40～50%。沒有必須的實(shí)驗(yàn)教學(xué)學(xué)時(shí)作保障，警察高校應(yīng)用型專業(yè)人才培養(yǎng)目標(biāo)就難以實(shí)現(xiàn)。

1.3.3 化學(xué)成分分析

依據(jù)全部測(cè)定單株鮮葉含油量，按從高到低排序，挑選含油量前166名的茶樹油為樣品，采用氣-質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行精油化學(xué)成分定性和定量分析。分析參照的標(biāo)準(zhǔn)為國際標(biāo)準(zhǔn)ISO4730—2017，組分含量用氣相色譜的面積歸一法確定[3]。另外，依據(jù)鮮葉含油量與精油中4-松油醇占比，計(jì)算鮮葉4-松油醇含量（g/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

選用Excel 2016整理原始數(shù)據(jù)，采用SAS 9.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算生長(zhǎng)性狀、鮮葉含油量和主要化學(xué)成分的均值、中位數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)誤、最大值、最小值和變異系數(shù)[13]。采用主成分分析法，計(jì)算樹高、胸徑、樹冠截面積、鮮葉含油量、4-松油醇占比共5個(gè)性狀的綜合變量及分量[13]，并求出權(quán)重[16]。優(yōu)良單株篩選采用綜合選擇指數(shù)法[14]，計(jì)算公式如下：

式中：IC為綜合選擇指數(shù)；為了避免選擇結(jié)果受目標(biāo)性狀觀測(cè)值數(shù)量級(jí)的影響，5個(gè)性狀采用群體校對(duì)均值與單株觀測(cè)值比值的百分?jǐn)?shù)；字母a，b，c，d和e為5個(gè)性狀的權(quán)重。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)性狀與化學(xué)成分分析

圖1列出了互葉白千層測(cè)定單株9個(gè)目標(biāo)性狀的統(tǒng)計(jì)值。在生長(zhǎng)量方面，4年生單株的平均樹高、胸徑和樹冠截面積分別為5.92 m、7.09 cm和2.07 m2，其變異系數(shù)分別達(dá)到15.38%、16.66%和44.74%，說明互葉白千層測(cè)定單株生長(zhǎng)性狀具有中等和較高程度的遺傳分化，具有可觀的遺傳選育潛力。

圖1 互葉白千層測(cè)定群體9個(gè)性狀的數(shù)據(jù)分布Fig. 1 Data distribution graph of 9 traits for studied M. alternifolia population

測(cè)定鮮葉精油含量發(fā)現(xiàn)，211株測(cè)定樣品的鮮葉平均含油量為10.27 g/kg，其中位數(shù)為10.21 g/kg，鮮葉最低和最高含油量分別為5.01 g/kg和17.01 g/kg，變異系數(shù)達(dá)到18.44%，說明引種資源的鮮葉含油量亦具有較豐富的遺傳分化。

精油化學(xué)成分分析結(jié)果顯示，各單株精油中1,8-桉葉油素、異松油烯、4-松油醇和檸檬烯占比差異較大，表明不同單株精油的有效成分含量與品質(zhì)存在明顯差異。主要化學(xué)成分4-松油醇占比較高，達(dá)到29.90%～48.67%，占比均值與中位數(shù)分別為40.26%和40.56%，說明絕大部分單株4-松油醇占比達(dá)到國際標(biāo)準(zhǔn)ISO4730—2017[9]規(guī)定的35%～48%的要求；單株間4-松油醇占比變異系數(shù)較低，僅為8.81%，說明單株間4-松油醇占比穩(wěn)定在一個(gè)較高水平。

精油（茶樹油）品質(zhì)方面，1,8-桉葉油素占比平均值為3.00%，但單株間差異明顯，在0.19%～9.19%之間，變異系數(shù)高達(dá)50.80%；對(duì)比國際標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)，全部單株的1,8-桉葉油素占比處于≤10%的合格范圍。檸檬烯占比相對(duì)集中，在1.12%～2.08%之間，變異系數(shù)為11.40%，其平均值與中位數(shù)分別為1.54%和1.51%；參照國際標(biāo)準(zhǔn)0.5%～1.5%發(fā)現(xiàn)，94株（56.62%）檸檬烯占比未達(dá)標(biāo)。異松油烯占比分布較為集中，在2.86%～5.01%之間，變異系數(shù)僅為9.14%，平均值為3.74%，對(duì)比國家標(biāo)準(zhǔn)1.5%～5.0%發(fā)現(xiàn)，僅有單株T075的占比（5.01%）未達(dá)規(guī)定要求，剩余165株全部達(dá)標(biāo)。

2.2 化學(xué)類型分析

4-松油醇、1,8-桉葉油素和異松油烯是劃分互葉白千層精油類型的3種決定性化學(xué)成分[3]。為了明確本試驗(yàn)中互葉白千層的化學(xué)類型，構(gòu)建了166株單株3種決定性化學(xué)成分占比的三維分布圖（圖2），發(fā)現(xiàn)157株（94.58%）的精油符合“化學(xué)1型”（Chemotype 1 ‘Type'）要求，屬于4-松油醇型，即4-松油醇占比在34%～54%之間，1,8-桉葉油素占比在0～8%之間，異松油烯占比在1%～5%之間。剩余9株（5.42%）屬于雜合類型，無法劃分成6種主要化學(xué)類型中的任何一種，其4-松油醇占比低于34%（為29.90%～33.82%），其中單株T075的異松油烯占比超過5%（為5.01%），單株T207的1,8-桉葉油素占比超過8%（為9.19%）。

2.3 相關(guān)性分析

表1列出了互葉白千層測(cè)定群體9個(gè)性狀間的Pearson相關(guān)系數(shù)。生長(zhǎng)性狀方面，樹高、胸徑和樹冠截面積相互間具有極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.334～0.611。鮮葉含油量與3個(gè)生長(zhǎng)性狀間均無明顯相關(guān)性，與精油中1,8-桉葉油素、異松油烯和4-松油烯占比亦無明顯相關(guān)性，但與檸檬烯有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（R2=-0.178）。精油核心有效成分4-松油醇與樹高存在極顯著正相關(guān)性（R2=0.219），與胸徑、樹冠截面積和鮮葉含油量均無明顯關(guān)系，與精油中1,8-桉葉油素、異松油烯和檸檬烯均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.807～-0.227。鮮葉4-松油醇含量取決于鮮葉含油量和4-松油醇占比，所以與二者均具有極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別高達(dá)0.900和0.531；鮮葉4-松油醇含量與3個(gè)生長(zhǎng)性狀均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，其中與胸徑的負(fù)相關(guān)性達(dá)到顯著水平（R2=-0.170）；另外，鮮葉4-松油醇含量與精油中1,8-桉葉油素、異松油烯和檸檬烯均存在顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.468～-0.190。

表1 互葉白千層測(cè)定群體9個(gè)性狀Pearson相關(guān)分析Table 1 Pearson correlations of 9 traits for testing M. alternifolia population

2.4 主成分分析及性狀權(quán)重測(cè)算

為了鑒別互葉白千層最關(guān)鍵的表型性狀，構(gòu)建優(yōu)良單株的選擇指標(biāo)體系，并測(cè)算各性狀的權(quán)重，本研究對(duì)影響單位面積4-松油醇產(chǎn)量的5個(gè)性狀進(jìn)行主成分分析[13,16]。從表2可知，前4個(gè)主成分分別解釋了總變異的40.44%、22.31%、16.65%和12.97%，累計(jì)解釋了總變異中的92.38%。第1個(gè)主成分主要貢獻(xiàn)性狀為3個(gè)生長(zhǎng)性狀，第2個(gè)主成分主要貢獻(xiàn)性狀為鮮葉含油量和精油中的4-松油醇占比。依據(jù)累計(jì)貢獻(xiàn)率超過85%的標(biāo)準(zhǔn)，選擇前4個(gè)主成分及相應(yīng)分量計(jì)算各性狀選擇權(quán)重，構(gòu)建優(yōu)良單株評(píng)選公式，根據(jù)公式（2）測(cè)算出綜合選擇指數(shù)，其中a為0.219，b為0.286，c為0.107，d為0.310，e為0.070。

表2 互葉白千層測(cè)定單株5個(gè)主要性狀主成分分析Table 2 Principle component analysis of 5 main traits for testing M. alternifolia individuals

2.5 優(yōu)良單株選擇

依據(jù)優(yōu)良單株評(píng)選公式，測(cè)算166株測(cè)試單株的綜合選擇指數(shù)IC，從高到低排序，按照15%入選率評(píng)選生物量、鮮葉含油量和4-松油醇占比綜合表現(xiàn)優(yōu)異的單株。表3列出了互葉白千層25株（15%）最優(yōu)單株的IC值，優(yōu)良單株IC值分布在110.55～130.63之間，明顯大于全體平均指數(shù)值100。同時(shí)，按照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO4730—2017要求，分析了影響精油品質(zhì)的化學(xué)成分占比，發(fā)現(xiàn)25株測(cè)試單株1,8-桉葉油素占比均小于6%，異松油烯占比均在1.5%～5.0%之間，即此2種化學(xué)成分占比均達(dá)到了國際安全標(biāo)準(zhǔn)（數(shù)據(jù)未列出）。但分析檸檬烯占比發(fā)現(xiàn)，25株中僅有12株達(dá)到國際標(biāo)準(zhǔn)，即占比在0.5%～1.5%之間。這12株符合國際標(biāo)準(zhǔn)的單株依次為：T129、T127、T158、T137、T176、T192、T201、T152、T211、T183、T159 和 T156。

表3 互葉白千層15%最優(yōu)單株綜合選擇指數(shù)Table 3 Composite selection indices for top 15% M. alternifolia individuals

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，25株優(yōu)良單株5個(gè)性狀平均值分別為7.00 m、8.35 cm、3.13 m2、11.80 g/kg、41.81%，其群體現(xiàn)實(shí)增益分別為14.50%、15.20%、46.21%、11.66%和3.85%；12株符合國際安全標(biāo)準(zhǔn)單株的性狀均值分別為7.15 m、8.42 cm、3.16 m2、11.95 g/kg和42.92%，其群體現(xiàn)實(shí)增益分別為16.96%、 16.07%、 47.63%、 13.08%和 6.61%（表4）。

表4 互葉白千層優(yōu)良單株現(xiàn)實(shí)增益分析Table 4 Realistic gain for selected superior individuals of M. alternifolia

3 結(jié)論與討論

1）本研究系統(tǒng)分析了粵北互葉白千層引種資源中211株單株的9個(gè)重要經(jīng)濟(jì)性狀，綜合評(píng)選出12株生長(zhǎng)迅速、鮮葉含油量高、精油中4-松油醇占比大、精油品質(zhì)達(dá)到國際標(biāo)準(zhǔn)ISO4730—2017要求的單株，為發(fā)展互葉白千層無性系資源林提供了重要物質(zhì)保障。我國20世紀(jì)90年代引進(jìn)互葉白千層后，主要栽種在廣東惠州和肇慶、廣西平南和欽州等南亞熱帶地區(qū)[10-12]。本研究將互葉白千層引種到粵北中亞熱帶地區(qū)，并通過生長(zhǎng)性狀測(cè)定與精油化學(xué)成分分析，證實(shí)其具有良好的生長(zhǎng)適應(yīng)性，且精油含量與廣西等地同類研究的9.1～13.5 g/kg近似[10,12]，這為拓寬我國互葉白千層生產(chǎn)區(qū)域提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2）引種資源目標(biāo)性狀遺傳變異程度與選育潛力緊密相關(guān)[13,17]。本研究發(fā)現(xiàn)，互葉白千層樹高和胸徑具有中等水平的遺傳分化，影響鮮葉產(chǎn)量的樹冠截面積分化非常明顯，變異系數(shù)達(dá)44.74%，為選育高生物量的無性系奠定了基礎(chǔ)。在精油產(chǎn)量方面，重要性狀鮮葉含油量與鮮葉4-松油醇含量均呈現(xiàn)出較高的遺傳分化，且4-松油醇占比穩(wěn)定在較高水平（變異系數(shù)僅為8.81%），為選育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)互葉白千層單株提供了保障。

3）互葉白千層精油化學(xué)類型及其品質(zhì)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值緊密相關(guān)[4]。當(dāng)前茶樹油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵是選育4-松油醇型優(yōu)良品系，即選育4-松油醇占比高、1,8-桉葉油素和檸檬烯占比低的品系[7-8]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，粵北引種群體中94.58%為4-松油醇型，5.42%為雜合類型。雜合類型的產(chǎn)生可能與種子園天然授粉過程中參雜其他類型花粉有關(guān)，這要求種植業(yè)主須進(jìn)一步優(yōu)化種植品系。精油品質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，1.20%的單株異松油烯或1,8-桉葉油素超標(biāo)，56.62%的單株檸檬烯占比超標(biāo)，進(jìn)一步說明粵北發(fā)展互葉白千層種植業(yè)需優(yōu)化遺傳材料的品質(zhì)。為了規(guī)避有性繁殖過程中的遺傳分化，建議選種高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的互葉白千層組培苗[11,18]，發(fā)展無性系原料林。

4）選育互葉白千層優(yōu)良單株，一個(gè)關(guān)鍵是選定影響單位面積4-松油醇產(chǎn)量與品質(zhì)的重要經(jīng)濟(jì)性狀，另一個(gè)關(guān)鍵是科學(xué)確定各經(jīng)濟(jì)性狀的權(quán)重[16]。本研究在構(gòu)建優(yōu)良單株評(píng)選指標(biāo)體系過程中，綜合考慮了單株生物量、鮮葉含油量、精油中4-松油醇占比、精油品質(zhì)關(guān)鍵成分占比等因素，并采用主成分分析法科學(xué)確定各經(jīng)濟(jì)性狀的權(quán)重。影響生物量的3個(gè)生長(zhǎng)性狀、鮮葉含油量和4-松油醇占比被選為正向選擇經(jīng)濟(jì)性狀，納入綜合選擇指數(shù)計(jì)算公式；影響精油品質(zhì)的1,8-桉葉油素、異松油烯和檸檬烯占比不直接決定4-松油醇產(chǎn)量，不宜作為正向選擇性狀，故未納入綜合選擇指數(shù)計(jì)算公式，但被選為評(píng)選體系的逆向淘汰性狀。經(jīng)濟(jì)性狀權(quán)重分析發(fā)現(xiàn)，4-松油醇占比權(quán)重偏低，僅0.070，這可能與全體測(cè)試單株精油中4-松油醇占比較高且變異幅度不大有關(guān)，亦再次說明測(cè)試單株的4-松油醇占比穩(wěn)定在較高水平。

5）鑒于粵北引種資源的遺傳背景不清楚，其雜交親本、組合配置、雜交數(shù)量不清晰，因而不能確定各單株表型性狀產(chǎn)生分化的遺傳機(jī)制。因此，有必要采用細(xì)胞學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)等方法，深入探索粵北互葉白千層的遺傳背景、遺傳變異規(guī)律及其產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)理，同時(shí)系統(tǒng)開展基因型與環(huán)境互作研究，為各發(fā)展區(qū)域選育適宜的優(yōu)良品系。