王小玲 幸學俊 高 柱,2 杜建華

( 1. 江西省科學院生物資源研究所，江西 南昌 330096；2. 江西農(nóng)業(yè)大學園林與藝術(shù)學院，江西 南昌 330045；3. 南昌工學院，江西 南昌 330108)

臍橙屬于耐陰性較強的果樹，對溫度的要求較高，適宜的生長溫度為23～33 ℃[1]。贛南是我國重要的臍橙生產(chǎn)基地，紐荷爾臍橙（Citrus sinensis‘Newhall'）聞名遐邇[2]。贛南屬典型的亞熱帶濕潤氣候，平均氣溫高于國內(nèi)外臍橙產(chǎn)區(qū)，7—9月，受西太平洋副熱帶高壓或大陸高壓控制，多為連續(xù)晴熱天氣，降水分配不均，氣溫高，蒸發(fā)大，因此每年都有不同程度的干旱發(fā)生，使臍橙生產(chǎn)受到嚴重危害。

正常情況下，植物通過抗氧化酶和抗氧化劑系統(tǒng)維持細胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡[3-4]。逆境（干旱、水淹、高溫、低溫等）條件下會產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-）、羥自由基（-OH）、單線態(tài)氧（1O2）、過氧化氫（H2O2）及脂類過氧化物等具有活潑化學性質(zhì)的ROS，當細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和積累速度大于抗氧化系統(tǒng)的清除速度時，細胞內(nèi)ROS大量積累，破壞膜系統(tǒng)的完整性和流動性，影響植物生長發(fā)育[5]。Foyer等[6]研究也證明，植物是通過提高自身高效的抗氧化酶和抗氧化劑系統(tǒng)來維持體內(nèi)ROS的動態(tài)平衡?？梢?，要提高高溫引起的贛南臍橙的抗干旱能力，就需要提高其抗氧化能力。為此，本試驗以紐荷爾臍橙為材料，研究不同生長時期，果實和葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和谷胱甘肽還原酶（GR）5種抗氧化酶活性的變化情況，探討臍橙抗氧化酶系統(tǒng)的氧化保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在江西省贛州市信豐縣龍舌村（東經(jīng)115°00′27″，北緯 25°23′44″，海拔 181.7 m）臍橙園進行，臍橙園土壤營養(yǎng)元素見表1。

表1 臍橙園土壤營養(yǎng)元素Table 1 Soil nutrients in navel orange orchard mg/kg

1.2 試材取樣及處理

選取10年生生長健康、結(jié)果穩(wěn)定的紐荷爾臍橙30株為試材，按照完全隨機區(qū)組設(shè)計每小區(qū)10株，3次重復。分別于7—11月每月20日9：00晴天采樣（如遇陰雨天氣提前或延后1～2 d），自樣株樹冠外圍結(jié)果枝中上部的4個方向采取健康果（外觀顏色和果實大小相當）8～10個，自植株樹冠外圍中上部新梢中部的4個方向采取健康葉片15～20片。采后立即洗凈擦干，然后將果肉切碎混勻，葉片去除主葉脈和1 cm葉緣后剪碎混勻，液氮中迅速冷凍，貯藏于-80 ℃超低溫冰箱，用于抗氧化酶系統(tǒng)（SOD、POD、CAT、APX和GR）活性測定。

1.3 試驗方法

SOD活性采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定，560 nm波長測定其OD值，以抑制NBT光化學還原50%為1個酶活性單位[7]。POD活性采用愈創(chuàng)木酚染色法測定，以愈創(chuàng)木酚為底物，470 nm波長測定其OD值，以每分鐘OD470變化（升高）0.01為1個酶活性單位[8]。CAT活性采用紫外吸收法測定，240 nm波長測定其OD值，以每分鐘OD240減少0.1為1個酶活性單位[9]。APX活性采用紫外吸收法測定，290 nm波長測定其OD值，根據(jù)每分鐘OD290值變化0.01定義為一個酶活性單位[10]。GR活性采用紫外吸收法測定，340 nm波長測定其OD值，以每分鐘OD340值變化0.01定義為1個酶活性單位[11]。SOD、POD、CAT、APX和GR活性采用南京建成生物工程研究所研制的酶活性測定試劑盒進行測定，測定的結(jié)果均以U/g表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計整理、SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用SigmaPlot 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 臍橙生長發(fā)育期果實和葉片SOD活性分析

SOD是植物體內(nèi)清除O2-的重要物質(zhì)，對保護細胞免遭氧化傷害起重要作用。由圖1可知，臍橙生長發(fā)育期果實和葉片SOD活性變化趨勢相反，果實SOD平均活性比葉片低11.29%。果實SOD活性先降低后升高，9月降到活性谷值，降幅為31.59%；葉片SOD活性先升高，后降低，9月出現(xiàn)活性峰值，升幅為82.34%，顯著高于其他月份；11月份，果實SOD活性高達349.51 U/g，高于葉片17.66%。產(chǎn)生以上結(jié)果與7—9月份贛南氣溫升高，臍橙葉片SOD酶消除細胞中產(chǎn)生的O2-作用增強，減輕了O2-引起的膜傷害，控制膜過氧化水平，從而保護葉片不受高溫脅迫的傷害。整個生長發(fā)育期，果實和葉片SOD活性變化相反，表明SOD酶在臍橙不同組織和不同發(fā)育時期起著不同的作用，果實和葉片清除活性氧的機制存在差異。

圖1 臍橙果實和葉片SOD活性變化Fig. 1 Change of SOD activity in fruits and leaves of navel orange

2.2 臍橙生長發(fā)育期果實和葉片POD活性分析

臍橙生長發(fā)育期果實和葉片POD活性均表現(xiàn)為“升高—降低”的趨勢（圖2），不同時期POD活性差異性顯著。果實POD活性不僅始終低于葉片，而且果實POD活性峰值出現(xiàn)的時間早于葉片30 d。9月份果實POD活性出現(xiàn)峰值126.45 U/g，增幅為33.09%；10月份葉片POD活性出現(xiàn)峰值161.49 U/g，增幅為45.80%。POD也是植物體內(nèi)重要的O2-清除酶，與SOD協(xié)同清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的O2-，且POD是在SOD之后發(fā)揮對自由基的清除作用[12]。因此，臍橙生長發(fā)育期，果實和葉片POD總活性小于SOD活性，果實POD活性變化趨勢不僅與SOD活性相反，而且活性峰值比葉片提前了30 d，表明POD酶是清除果實體內(nèi)O2-的主要抗氧化酶。

圖1 臍橙果實和葉片POD活性變化Fig. 2 Change of POD activity in fruits and leaves of navel orange

2.3 臍橙生長發(fā)育期果實和葉片CAT活性分析

CAT是存在于細胞的過氧化體中以H2O2為底物的酶，將細胞內(nèi)過多的H2O2催化為O2和H2O，避免細胞受到H2O2毒害，以此發(fā)揮其抗氧化作用。臍橙生長發(fā)育期果實和葉片CAT活性是“先升高，后降低”（圖3），與POD活性變化趨勢一致。葉片CAT活性始終高于果實，其平均活性高于果實39.81%。9月份，果實和葉片CAT活性同時達到峰值125.46 U/g和193.47 U/g，增幅分別為48.72%和83.75%；9—11月，果實CAT活性下降緩慢，降幅為26.30%，葉片CAT活性迅速下降，降幅為41.28%。這與細胞承受的逆境能力有關(guān)，7—9月贛南氣溫上升，臍橙果實和葉片體內(nèi)H2O2積累量增加，CAT活性被活化，進而加速了體內(nèi)H2O2的分解，降低了O2-的積累，提高抗氧化能力，緩解高溫脅迫。

圖3 臍橙果實和葉片CAT活性變化Fig. 3 Change of CAT activity in fruits and leaves of navel orange

2.4 臍橙生長發(fā)育期果實和葉片APX活性分析

APX主要存在于植物葉綠體和細胞質(zhì)中，是葉綠體中清除H2O2的關(guān)鍵酶，其活性升高，O2-產(chǎn)生速率下降，脂質(zhì)過氧化作用減弱[13-14]。由圖4可知，葉片APX活性始終高于果實，其平均活性高于果實42.29%。7—9月，果實和葉片CAT活性逐漸升高，9月份同時達到峰值60.18 U/g和88.79 U/g，分別增加了134.35%和109.16%；9—11月，果實和葉片APX活性逐漸降低，分別降低了62.81%和55.54%。對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生長發(fā)育期果實和葉片APX活性變化趨勢與CAT活性相同，但是果實和葉片APX活性極顯著高于CAT活性，分別是其活性的2.58倍和2.54倍。因此，APX在臍橙植物體抗氧化中發(fā)揮著重要作用，這與其參與葉綠體和細胞質(zhì)的H2O2代謝有關(guān)。

圖4 臍橙果實和葉片APX活性變化Fig. 4 Change of APX activity in fruits and leaves of navel orange

2.5 臍橙生長發(fā)育期果實和葉片GR活性分析

GR是一種利用還原型NADP將氧化型谷胱甘肽（GSSG）催化成還原型谷胱甘肽（GSH）的酶，為H2O2的清除提供還原力[15]。生長發(fā)育期果實GR活性從7月的6.62 U/g逐漸升高，10月達到峰值24.97 U/g，增幅為277.03%，10—11月逐漸降低了41.21%；葉片GR活性從7月份的10.86 U/g FW逐漸升高，9月達到峰值28.54 U/g，增幅為162.88%，9—11月逐漸降低了39.59%。GR活性的變化與POD活性存在一定的差異性，POD活性果實峰值早于葉片30 d，而GR活性果實峰值晚于葉片30 d。該研究結(jié)果與2種酶在參與植物抗氧化過程中所起的作用有關(guān)。

圖5 臍橙果實和葉片GR活性變化Fig. 5 Change of GR activity in fruits and leaves of navel orange

3 結(jié)論與討論

植物經(jīng)過長期的進化形成了抵御逆境脅迫的抗氧化系統(tǒng)，維持植物體內(nèi)ROS代謝的動態(tài)平衡，這是植物抵御逆境脅迫傷害的重要機制[16]。SOD是ROS清除機制中第1個發(fā)揮作用的抗氧化酶[17]，被稱為保護機制的中心[18]。POD是廣泛存在于植物體內(nèi)的氧化還原酶，以H2O2作為氧化劑生成H2O。CAT則是以專一性底物H2O2反應(yīng)生成H2O和O2的氧化酶，主要存在于葉綠體和細胞的過氧化物內(nèi)[19]。SOD能使超氧化物發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2和H2O2，生成的O2和H2O2再經(jīng)POD和CAT催化生成水，由此降低或解除了O2-對細胞內(nèi)物質(zhì)的直接傷害[20-21]。APX是一類參與植物細胞AsA-GSH循環(huán)的重要酶類[22]，以抗壞血酸為電子供體，快速催化細胞中產(chǎn)生的過量H2O2分解生成H2O和O2，保護葉綠體和其他細胞組分免受活性氧毒害，從而提高植物對氧化脅迫的耐受性[23]。而GR又是一種利用還原型NADP將氧化型谷胱甘肽（GSSG）催化成還原型谷胱甘肽（GSH）的酶，可提高GSH含量，為ROS的清除提供還原力[15]。

本研究通過分析臍橙生長發(fā)育過程中SOD、POD、CAT、APX和GR活性變化可知，不同發(fā)育時期，果實和葉片5種抗氧化酶活性差異性顯著，不同抗氧化酶之間存在著協(xié)作機制，其中SOD活性最大，CAT和POD次之，APX和GR活性最小。葉片5種抗氧化酶活性均高于果實，葉片抗氧化酶活性均呈現(xiàn)“升高—降低”的趨勢，表明發(fā)育期末，葉片抗氧化酶活性的降低將導致內(nèi)部氧化—抗氧化平衡的打破和葉片的衰老加速，這與華安明等[24]的研究結(jié)果一致。同時，隨著7—9月份贛南氣溫逐漸升高，果實4種抗氧化酶（CAT、POD、APX、GR）和葉片5種抗氧化酶活性都是逐漸升高，表明高活性的SOD酶會導致植物體內(nèi)H2O2的大量積累，為降低過氧化物對植物細胞功能的損壞，需要依賴CAT和POD 2種酶的共同作用來催化H2O2生成水，以達到清除高溫脅迫下臍橙植物體積累的ROS目的，因此SOD、CAT和POD共同組成臍橙植物體關(guān)鍵的保護酶系統(tǒng)。APX和GR酶則協(xié)助臍橙關(guān)鍵酶系統(tǒng)清除體內(nèi)積累的過量ROS?？梢姡琒OD、POD、CAT、APX和GR在臍橙植物體ROS的清除中相互調(diào)節(jié)，共同參與調(diào)控ROS代謝和細胞脂過氧化程度，是臍橙植物體抗高溫脅迫的一種響應(yīng)機制，為贛南臍橙的抗高溫栽培和品種選育提供了參考。