耿樹香，寧德魯，賀 娜，肖良俊，方文亮

(云南省林業(yè)和草原科學院，昆明 650201)

云南‘三臺’核桃屬鐵核桃(JuglanssigillataDode)種，主產(chǎn)于云南省楚雄州大姚縣，屬傳統(tǒng)農(nóng)家栽培品種，是經(jīng)過長期天然和人工選育的優(yōu)良核桃品種，具有殼薄、光滑、刻紋淺細、取仁容易、仁黃味香、出油率高及利于加工等優(yōu)點，是目前云南省四大優(yōu)良核桃品種之一[1]。

研究表明，鐵核桃果實中粗脂肪含量平均為61.051%，核桃油中除富含多種不飽和脂肪酸外，還含有豐富的功能性成分，如維生素E、磷脂、角鯊烯等，核桃仁中粗脂肪含量、粗蛋白質含量、氨基酸總量、維生素E含量、褪黑素含量和磷脂含量的變異系數(shù)均較小，說明這6種營養(yǎng)成分遺傳穩(wěn)定性好[2-3]?，F(xiàn)有研究集中于普通核桃(JuglansregiaL.)中的蛋白質、脂肪等營養(yǎng)指標及部分生理活性成分[4-8]，而對鐵核桃相關研究較少，且集中于鐵核桃成熟后營養(yǎng)成分的研究[9-12]，而缺乏對不同發(fā)育期云南核桃組分的研究。本文對云南鐵核桃種中的‘三臺’品種4個不同發(fā)育期主要營養(yǎng)成分油脂、脂肪酸、膳食纖維、粗蛋白質、氨基酸、維生素等指標進行系統(tǒng)分析，以期為云南鐵核桃的整個生理發(fā)育代謝提供數(shù)據(jù)支持，為后期云南鐵核桃分子育種中尋找相關功能基因及主要代謝通路奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以云南大姚‘三臺’核桃品種為試驗對象，在授粉后30、60、90、120 d，分別在所選3株同一‘三臺’品種株樣樹冠中部的東西南北4個方位隨機采摘果實50個，脫皮取仁45℃烘箱干燥至恒重，置于帶硅膠的干燥器保存，備用。

甲醇、乙腈、乙醇均為色譜純(Merck)；磷、鐵標準溶液，質量濃度為1 000 μg/mL(購于國家標準物質研究中心)；正己烷、氫氧化鈉、三氟化硼均為優(yōu)級純。

液相色譜串聯(lián)四級桿質譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)，氣相色譜-四級桿飛行時間質譜聯(lián)用儀(GC-Q-TOF)。

1.2 試驗方法

1.2.1 基本指標的測定

蛋白質，依據(jù)GB 5009.5—2016中第一法檢測；含油率，依據(jù)GB 5009.6—2016中第二法檢測；膳食纖維，依據(jù)GB 5009.88—2014檢測；磷脂，依據(jù) GB/T 5537—2008中第二法檢測；磷元素，依據(jù)GB 5009.87—2016檢測；鐵元素，依據(jù)GB 5009.90—2016檢測。

1.2.2 維生素的測定

維生素C，依據(jù)GB 5009.86—2016檢測。維生素E，依據(jù)GB 5009.82—2016中第一法檢測。維生素B3，采用LC-MS/MS測定，具體測定方法如下:①樣品提取。利用研磨儀研磨樣品至粉狀，稱取100 mg溶于水中，置于4℃冰箱過夜，期間渦旋3次以提高提取率，然后在10 000g下離心10 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔過濾膜過濾稀釋后進行LC-MS/MS測定。②LC-MS/MS測定條件。Acquity UPLC H CLASS液相色譜儀；配AcquityTQD檢測器的質譜儀；ACQUITY UPLCr HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；柱溫40℃；進樣量2 μL；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸溶液，洗脫時間6 min，梯度比例見表1；電噴霧離子源(ESI)溫度500℃，質譜電壓5 500 V,簾氣(CUR)172.4 kPa,碰撞誘導電離(CAD)參數(shù)設置為高。在三重四級桿(QQQ)中，每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(DP)和碰撞能進行掃描檢測。

表1 梯度比例

1.2.3 20種氨基酸組成的測定

取一定量的核桃仁樣品，粉碎，過40目篩，混勻。稱取約100 mg(精確至0.000 1 g)混勻后樣品，置于20 mL水解管中，加入15 mL鹽酸溶液(鹽酸與超純水體積比1∶1)，在水解管中充入高純氮氣，密封。將水解管放入(110±1)℃恒溫烘箱中，水解22 h，取出后冷卻。將冷卻后的水解液過濾，取200 μL至10 mL試管中，蒸干，加入1 mL超純水(除氨)復溶后，再蒸干。用1 mL pH 2.2的緩沖液溶解后過0.45 μm有機濾膜，上機分析。

測試條件：液相采用Acquity UPLC H CLASS；質譜采用AcquitySQD2檢測器；ACQUITY UPLCr HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；柱溫35℃；進樣量2 μL；流動相A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液，洗脫時間8 min，梯度比例見表2。

表2 梯度比例

1.2.4 油脂脂肪酸組成的測定

采用GC-Q-TOF測定脂肪酸組成。稱取5 g核桃仁樣品，分別用10 mL正己烷超聲提取3次，氮吹干，得到核桃油。稱取約0.05 g核桃油于燒瓶中，加入2%氫氧化鈉-甲醇溶液8 mL，(80±1)℃水浴回流直至油滴消失，加入7 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，(80±1)℃水浴中繼續(xù)回流2 min。停止加熱，從水浴上取下燒瓶，迅速冷卻至室溫，加入約5 mL正庚烷振搖2 min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取上層正庚烷提取溶液約5 mL至15 mL試管中，加入3～5 g無水硫酸鈉，振搖1 min，靜置5 min,吸取上層溶液到進樣瓶中待測定。

測定條件：安捷倫7890B-5977B氣相色譜儀；TG-WAX色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；程序升溫為初始溫度120℃，以3℃/min升至280℃；進樣口溫度270℃；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；柱前壓100 kPa；進樣量0.5 μL；分流比10∶1。采用質譜定性，面積歸一化法定量。

1.2.5 油脂中角鯊烯的測定

采用GC-Q-TOF測定角鯊烯。取1.2.4中

提取的核桃油0.1 g，加入約2 mL 2 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液，密封，搖晃均勻，在80℃水浴下皂化40 min，每隔10 min振搖30 s。反應結束后，放入冷水中迅速冷卻至室溫，然后加入1 mL水和5 mL正己烷，密封振蕩2 min，靜置分層，將上層清液轉移至40 mL玻璃樣品瓶中，下層再分別用5 mL正己烷重復萃取3次，合并3次萃取液，在80℃水浴下蒸干，取出小瓶，以移液管向其中加入5 mL正己烷定容，用1 mL注射器取溶液過0.22 μm濾膜，轉移至安捷倫小瓶中，待測。

測定條件：TG-5MS色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，進樣口溫度300℃，其他條件同1.2.4。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010建立原始數(shù)據(jù)表，并進行初步分析，運用SPSS 21.0進行營養(yǎng)成分相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)育期‘三臺’核桃含油率及脂肪酸組成變化(見表3)

表3 不同發(fā)育期‘三臺’核桃含油率及主要脂肪酸組成變化 %

由表3可見：‘三臺’核桃含油率在整個生長期逐漸升高，特別是在前3個發(fā)育期，油脂急劇積累，含量顯著增高，而從第3到第4發(fā)育期，油脂積累趨于平穩(wěn)；棕櫚酸在第1發(fā)育期含量較高，后期含量漸低，至含量為8%左右平穩(wěn)；棕櫚烯酸在前3個發(fā)育期含量逐漸降低，從第2到第3發(fā)育期，降幅趨于平緩，在第4發(fā)育期稍有升高；硬脂酸在整個發(fā)育期含量變幅不大，在1.91%～3.40%之間；油酸在前3個發(fā)育期含量逐漸升高,在3.39%～26.75%之間；亞油酸在第1發(fā)育期含量最低，為38.16%，在第2發(fā)育期含量最高，為57.37%，從而導致這一時期的多不飽和脂肪酸(PUFA)在整個生長期含量最高，達75.60%；亞麻酸在前3個發(fā)育期含量急劇降低，為26.09%～9.26%，在油脂積累初期含量最高，在第4發(fā)育期含量最低。在‘三臺’核桃的4個發(fā)育期中均檢出少量芥酸，在油脂積累初期含量最高，為0.398%，隨發(fā)育期延長降至0.023%，而在普通核桃中未檢出芥酸[8]。飽和脂肪酸(SFA)含量從第1發(fā)育期到第2發(fā)育期下降較多，而后期下降幅度較小，單不飽和脂肪酸(MUFA)含量在4個發(fā)育期中先升高后略有下降，多不飽和脂肪酸(PUFA)含量在第2發(fā)育期最高。脂肪酸生物合成是植物體內最重要的代謝途徑之一，是一個復雜的碳源分配過程，其含量的高低由脂肪酸合成酶控制，核桃脂肪代謝調控機制是以核桃含油率及脂肪酸組成為基礎。后期可通過不同發(fā)育期‘三臺’核桃轉錄組數(shù)據(jù)分析，觀察調控核桃油脂組成基因表達水平，找到控制脂肪酸組成關鍵基因，闡明核桃營養(yǎng)物質代謝遺傳調控機制。

不同發(fā)育期‘三臺’核桃含油率和脂肪酸組成相關性分析見表4。

由表4可見：在‘三臺’核桃的4個發(fā)育期，含油率與亞麻酸呈極顯著的負相關，與油酸呈顯著正相關，與棕櫚酸呈顯著負相關；棕櫚酸與棕櫚烯酸呈極顯著正相關；油酸與亞麻酸呈顯著負相關。

表4 不同發(fā)育期‘三臺’核桃含油率和脂肪酸組成相關性分析

2.2 不同發(fā)育期‘三臺’核桃蛋白質含量及氨基酸組成變化(見表5)

對核桃樣品蛋白質含量測定結果表明，核桃授粉后30、60、90、120 d采集樣品的蛋白質含量分別為(1.96±0.85)%、(17.8±1.25)%、(15.0±2.18)%、(16.5±1.37)%?！_’核桃蛋白質含量在第2發(fā)育期時最高，而在第1發(fā)育期最低。不同發(fā)育期‘三臺’核桃仁中氨基酸組成變化見表5。

表5 不同發(fā)育期‘三臺’核桃仁中氨基酸組成變化 mg/kg

由表5可見，‘三臺’核桃不同發(fā)育期樣品中共檢出13種氨基酸，包括色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸7種人體必需氨基酸。13種氨基酸均在第2發(fā)育期含量相對較高。精氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、天門冬酰胺在第1發(fā)育期未檢出。大部分氨基酸在第4發(fā)育期繼續(xù)下降，只有5種氨基酸含量升高。4個發(fā)育期的總氨基酸含量在775.0～7 554.0 mg/kg之間，人體必需氨基酸含量在546.0～3 836.0 mg/kg之間。

2.3 不同發(fā)育期‘三臺’核桃中維生素C、維生素B3、磷、鐵、膳食纖維及核桃油中維生素E、角鯊烯、磷脂的變化(見表6)

表6 不同發(fā)育期‘三臺’核桃中維生素C、維生素B3、磷、鐵、膳食纖維及核桃油中維生素E、角鯊烯、磷脂的變化

由表6可見：維生素C含量在4個發(fā)育期逐漸升高；4個發(fā)育期中維生素B3含量在3.60～6.40 mg/kg之間，第3發(fā)育期含量最低；磷元素含量也是在第2發(fā)育期最高，可達4 998.0 mg/kg；4個發(fā)育期中鐵元素含量在26.03～36.06 mg/kg之間，變化幅度不大；膳食纖維含量在油脂積累初期最高，為37.10 g/100 g；脂溶性維生素E含量在121.0～381.0 μg/g之間，在第2發(fā)育期最高，這也是油脂積累最活躍期；角鯊烯含量在油脂積累活躍期即第2發(fā)育期最高，為21.62 mg/kg；磷脂含量在第3發(fā)育期最高，為100.90 mg/kg，第2發(fā)育期最低。

核桃種子的形成有兩個重要階段，胚的形成及種子成熟，在其種子發(fā)育期，干重和鮮重迅速增加，油脂、蛋白質和RNA合成速率加快，蛋白質及油脂快速積累?！_’核桃中的蛋白質含量在第2發(fā)育期最高，膳食纖維含量在第1發(fā)育期最高，而含油率在第3發(fā)育期急劇升高，這也許是在油脂積累過程中，大量與油脂合成相關基因表達升高，油脂中不同脂肪酸成分發(fā)生變化，從而導致每一發(fā)育期油脂脂肪酸不盡相同，同時含油率也不斷升高。核桃蛋白中的總氨基酸和必需氨基酸含量均在第2發(fā)育期最高，是核桃油脂急劇積累前期的物質貯備。

3 結 論

‘三臺’核桃在授粉30、60、90、120 d的發(fā)育過程中，油脂積累呈穩(wěn)定上升趨勢，在第4發(fā)育期含油率達67.3%。核桃油脂肪酸主要是C16及C18脂肪酸。在‘三臺’核桃4個發(fā)育期，核桃油中均檢出芥酸，且在第1發(fā)育期含量最高，為0.398%，而在第4發(fā)育期含量最低，為0.023%。核桃油中飽和脂肪酸(SFA)含量從第1發(fā)育期到第2發(fā)育期下降較多，而后期下降幅度較小，單不飽和脂肪酸(MUFA)含量在4個發(fā)育期中先升高后略有下降，多不飽和脂肪酸(PUFA)含量在第2發(fā)育期最高。核桃油中脂溶性成分角鯊烯含量在第2發(fā)育期最高，而磷脂含量在第3發(fā)育期最高。水溶性維生素C與維生素B3含量均在第4發(fā)育期時最高，而脂溶性維生素E含量則在第2發(fā)育期最高。