羅建勇，吳晨孛，黃雋光，周泓江，錢 芳,，郭 峰，黃立新

(1.廣州雙橋股份有限公司，廣州 510280； 2.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

啤酒是世界上產(chǎn)量最大、酒精含量低、營養(yǎng)價(jià)值豐富的酒種。2002年我國的啤酒產(chǎn)量為2 386.83萬t，開始超過美國成為世界第一[1-2]，之后我國的啤酒產(chǎn)量就一直穩(wěn)居世界前列。2000年前，我國的啤酒企業(yè)以大麥為主要原料、大米為輔料生產(chǎn)淡爽型等各式啤酒。隨著啤酒行業(yè)的快速發(fā)展，產(chǎn)量逐年攀升，對(duì)大麥、大米的需求量日益增加，價(jià)格大幅上揚(yáng)。2002年以來，進(jìn)口大麥不但價(jià)格漲幅大，而且質(zhì)量不穩(wěn)定，給國內(nèi)啤酒行業(yè)帶來很大影響[2]。許多廠家開始試驗(yàn)使用啤酒用糖漿作為啤酒的輔料，達(dá)到縮短釀造周期、提高原料利用率、降低生產(chǎn)成本、擴(kuò)大產(chǎn)能等目的，為啤酒和淀粉糖行業(yè)帶來了較好的經(jīng)濟(jì)效益。

由玉米淀粉或木薯淀粉經(jīng)酶法制備的啤酒用糖漿，含有麥芽糖、單糖組分，適于啤酒釀造。然而，這類淀粉糖漿主要為碳源物質(zhì)，添加過多造成體系氮源偏少，對(duì)啤酒釀造及其產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生不利影響。對(duì)于啤酒麥汁的含氮物質(zhì)，不僅有含量要求，而且對(duì)其分子大小有要求，由此Lundin提出了A、B、C區(qū)分法，又稱為蛋白質(zhì)的隆丁(Lundin)區(qū)分法[3]。隆丁區(qū)分一般要求高分子含氮物質(zhì)占25%，中分子含氮物質(zhì)占15%，低分子含氮物質(zhì)占60%，在此條件下較有利于酵母發(fā)酵和形成啤酒良好的風(fēng)味和泡沫[3～5]。大豆蛋白含氮量高、產(chǎn)量大、來源廣，為重要的食品原料,但其相對(duì)分子質(zhì)量大，80%以上的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大于10萬Da，如果要將其添加到淀粉糖漿中用于啤酒發(fā)酵，需要進(jìn)一步水解，達(dá)到啤酒對(duì)氮源物質(zhì)Lundin區(qū)分的分布要求。

Alcalase蛋白酶屬于微生物蛋白酶，酶解蛋白質(zhì)的效果好，是一種較為理想的酶制劑[6-10]。在企業(yè)開發(fā)啤酒用糖漿的基礎(chǔ)上，本文采用Alcalase蛋白酶在不同的酶解條件下酶解大豆蛋白，研究測定其大豆蛋白酶解液的蛋白質(zhì)回收率、水解度、Lundin區(qū)分的變化及其SDS-PAGE凝膠電泳特性，探討酶解制備大豆蛋白酶解液的條件，以期與啤酒用糖漿復(fù)配使用更適于啤酒的發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆蛋白，山東香馳豆業(yè)科技有限公司；Alcalase堿性蛋白酶(酶活力2.4 AU/g)，諾維信公司。三氯乙酸、高嶺土、濃硫酸、濃鹽酸等為分析純，無水碳酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀為基準(zhǔn)純，L-酪氨酸、甘氨酸、干酪素為生化試劑，丙烯酰氨、N，N′-甲叉雙丙烯酰氨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍(lán)R-250、十二烷基硫酸鈉和電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品均為電泳純。

PHS-3C型pH計(jì)，F(xiàn)A1004電子分析天平，KHW-D-1電熱恒溫水浴渦，79-3型恒溫磁力攪拌器，JJ-1增力電動(dòng)攪拌器，KDN-2C型凱氏定氮儀，KDN型消化爐，TDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī)，DYCG-30型電泳槽。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆蛋白酶解液制備

準(zhǔn)確稱取一定量的大豆蛋白，加入一定量蒸餾水，攪拌均勻，在(80±2)℃處理15 min，冷卻至預(yù)定溫度后恒溫水浴，調(diào)節(jié)pH至設(shè)定值。加入一定量的酶粉(液)，配制成設(shè)定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的反應(yīng)液，緩慢攪拌，反應(yīng)過程用0.5 mol/L NaOH溶液滴定維持體系在預(yù)定的pH。反應(yīng)到預(yù)定時(shí)間后，立即放入85℃或100℃水浴中加熱15 min鈍化蛋白酶，冷卻后在4 800 r/min下離心20 min，取上清液，于冰箱冷藏。采用pH-state法測定大豆蛋白酶解過程的水解度[11]。

1.2.2 干固物含量的測定

采用常壓干燥法[12]測定。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定

參照GB 5009.5—2016的方法測定，換算系數(shù)為5.71。

1.2.4 蛋白質(zhì)回收率的計(jì)算

大豆蛋白酶解后，計(jì)量酶解離心后上清液的質(zhì)量。準(zhǔn)確稱取約1.000 g的蛋白酶解液，用凱氏定氮法消化、定氮，測定上清液中蛋白質(zhì)含量，按下式計(jì)算蛋白質(zhì)回收率。

1.2.5 隆丁區(qū)分[13]

高分子含氮物質(zhì)在酸性溶液中易被單寧所沉淀，磷鉬酸可同時(shí)沉淀高、中分子含氮物質(zhì)。低分子含氮物質(zhì)則不為上述試劑所沉淀。因此，將樣品用硫酸酸化后，加單寧使高分子含氮物質(zhì)沉淀，測定濾液的含氮量，從總氮中減去此值即可得到高分子含氮物質(zhì)的含氮量(A區(qū)分)。另一份樣品用磷鉬酸沉淀，測定濾液中的含氮量，即為低分子含氮物質(zhì)的含氮量(C區(qū)分)。用單寧沉淀高分子含氮物質(zhì)后的濾液含氮量減去低分子含氮物質(zhì)的含氮量，即為中分子物質(zhì)的含氮量(B區(qū)分)。

1.2.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析[14]

標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和分析樣品在同一塊凝膠上進(jìn)行電泳，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)作圖，可以獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知蛋白的遷移率，可得到未知樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶量對(duì)大豆蛋白酶解產(chǎn)物的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，酶解溫度55℃，pH 8.0，分別在500、750 U/g和1 000 U/g的酶量下進(jìn)行酶解，隨著酶解的進(jìn)行，體系pH逐漸下降，過程滴加0.5 mol/L的NaOH保持pH為8.0。取不同時(shí)間段的酶解液測量其蛋白質(zhì)回收率和水解度、酶解液Lundin分布以及電泳后的相對(duì)分子質(zhì)量分布，結(jié)果見圖1～圖3。

由圖1可見，隨著酶量的增加，蛋白質(zhì)回收率不斷增大，大分子蛋白不斷被酶解成相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)和多肽。反應(yīng)2 h時(shí)，蛋白質(zhì)回收率接近峰值；此后隨著時(shí)間延長，蛋白質(zhì)回收率有所減小。該酶解是一個(gè)較復(fù)雜的變化過程，在大分子蛋白被酶解成小分子蛋白和多肽的同時(shí)，這些小分子蛋白和多肽也能夠經(jīng)過相互作用，再次聚集成相對(duì)分子質(zhì)量稍大的蛋白質(zhì)，使得體系的蛋白質(zhì)回收率有所降低。隨著酶量的增加和酶解時(shí)間的延長，大豆蛋白水解度呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。在水解初期的30～40 min內(nèi)，水解速率與酶量呈正相關(guān)，水解度上升很快；1 h后水解度上升速度逐漸放緩，至2 h以后水解度趨于一個(gè)極限穩(wěn)定值；不同的酶量，其極限值不同，與酶量呈正相關(guān)。

注：1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品；2.反應(yīng)0.5 h樣品；3.反應(yīng)1 h樣品；4.反應(yīng)1.5 h樣品；5.反應(yīng)2 h樣品。下同。

由圖2可見：隨著酶量增加和酶解時(shí)間的延長，C區(qū)分的含量最大，占比超過60%，且變化較??；A區(qū)分的變化最為顯著，含量在20%以下，顯示大分子的蛋白質(zhì)被酶解的最多。尤其在較高的酶量下，A區(qū)分含量隨酶解的進(jìn)行，下降明顯；B區(qū)分的含量總體呈下降趨勢，當(dāng)酶量為750 U/g時(shí)，1 h和4 h的B區(qū)分含量比較接近，在2 h時(shí)反而有所上升?？赡茉诿附膺^程中，Alcalase堿性蛋白酶首先將大豆蛋白切斷成為相對(duì)分子質(zhì)量在12 000～30 000 Da的B區(qū)分的多肽，然后又將B區(qū)分的多肽酶解成相對(duì)分子質(zhì)量更小的C區(qū)分的多肽、小肽，在單位時(shí)間段，前者酶解生成的B區(qū)分的數(shù)量以及C區(qū)分的多肽、小肽可能復(fù)合形成的B區(qū)分的數(shù)量之和，大于后者B區(qū)分酶解的數(shù)量，從而出現(xiàn)B區(qū)分反而有所增多的現(xiàn)象。

由圖3可見：隨著酶量增加與酶解時(shí)間的延長，大分子蛋白質(zhì)不斷減少；當(dāng)酶量為1 000 U/g時(shí)，酶解0.5 h的酶解液樣品，其相對(duì)分子質(zhì)量基本在25 000 Da以下，相較于麥汁的一般Lundin分布來說，A區(qū)分含量較少。因此，考慮啤酒的營養(yǎng)要求與酶解效果，選取酶量為750 U/g。

2.2 pH對(duì)大豆蛋白酶解產(chǎn)物的影響

Alcalase堿性蛋白酶的最適pH為8.0。本實(shí)驗(yàn)底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，酶解溫度55℃，酶量750 U/g，分別在pH為7.0、8.0和9.0下進(jìn)行酶解，過程滴加0.5 mol/L NaOH保持pH不變。取不同時(shí)間段的酶解液測量其蛋白質(zhì)回收率和水解度、酶解液Lundin分布以及電泳后的相對(duì)分子質(zhì)量分布，結(jié)果見圖4～圖6。

圖6 不同pH條件下隨反應(yīng)時(shí)間變化所得酶解液的SDS-PAGE圖譜

圖4 pH對(duì)蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

由圖4可見，隨pH增加和反應(yīng)時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)回收率先增大后趨于平穩(wěn)。Alcalase屬于堿性蛋白酶，在堿性環(huán)境酶解效果較好，pH為8.0和9.0時(shí)，蛋白質(zhì)回收率相差不大。當(dāng)pH增大，逐漸接近Alcalase的最適反應(yīng)pH時(shí)，其水解度呈明顯的上升趨勢，但當(dāng)pH超過8.0時(shí)，水解度的變化并不大?？紤]到堿性較高會(huì)引起酶解液苦味加重，且可能產(chǎn)生不愉快的堿味，影響后續(xù)發(fā)酵液的感官品質(zhì)，因此選擇pH 8.0的酶解條件較為適宜。

由圖5可見，在pH 7.0～9.0下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，C區(qū)分的含量都最大，占比超過60%，且變化較小。另外，pH對(duì)于Lundin分布的影響小于酶量的影響。Alcalase屬于堿性蛋白酶，在中性條件下酶解效果較弱，pH 7.0時(shí)高分子蛋白含量比較多，A區(qū)分含量較高。

對(duì)于在pH 9.0下1～4 h階段的酶解，B區(qū)分分布相近；反應(yīng)4.0～6.0 h，此階段大分子的蛋白質(zhì)絕大多數(shù)已經(jīng)不再被酶解了，繼續(xù)生成B區(qū)分的數(shù)量有限，由此導(dǎo)致B區(qū)分的增加變??；而B區(qū)分還有相當(dāng)數(shù)量又繼續(xù)被酶解成C區(qū)分，由此導(dǎo)致B區(qū)分含量降低?？梢?，可以利用酶解pH的變化控制大豆酶解液中高分子蛋白的含量。

由圖6可見，隨著pH增大，反應(yīng)所得酶解液的相對(duì)分子質(zhì)量逐漸降低，但是降低的趨勢較為緩慢。當(dāng)pH增大到9.0時(shí)，反應(yīng)2 h仍有少量20 100 Da左右的多肽存在，pH對(duì)蛋白質(zhì)回收率的影響小于酶量對(duì)蛋白質(zhì)回收率的影響，考慮到水解度以及對(duì)后續(xù)發(fā)酵液的影響，選取pH為8.0。

2.3 酶解溫度對(duì)大豆蛋白酶解產(chǎn)物的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，pH 8.0，酶量750 U/g，分別在50、55、60、65℃下進(jìn)行酶解，過程滴加0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH 8.0。取不同時(shí)間段的酶解液測定其蛋白質(zhì)回收率和水解度、酶解液Lundin分布以及電泳后的相對(duì)分子質(zhì)量分布，結(jié)果見圖7～圖9。

圖9 不同酶解溫度條件下隨反應(yīng)時(shí)間變化所得酶解液的SDS-PAGE圖譜

圖7 酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

由圖7可見，在50～65℃的酶解溫度范圍，蛋白質(zhì)回收率先隨溫度上升而增大，55℃有較大或最大的蛋白質(zhì)回收率，然后開始降低?？赡芨邷丶铀倭诵》肿与牡木酆献饔?，重新生成了相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白，使可溶性蛋白的含量降低。在50～65℃的溫度范圍，蛋白質(zhì)回收率隨反應(yīng)的進(jìn)行而增大，3.0 h時(shí)具有最大值，然后開始下降；65℃下蛋白質(zhì)回收率的變化較大，反應(yīng)4.0 h之后，蛋白質(zhì)回收率降低幅度大。

從圖8可見，酶解溫度對(duì)Lundin分布的影響較為顯著。當(dāng)酶解溫度高于55℃，使酶活力有所降低，導(dǎo)致A、B區(qū)分的含量產(chǎn)生明顯變化。當(dāng)酶解溫度為65℃時(shí)，A區(qū)分含量相對(duì)較高，與圖7 65℃的變化曲線一致。

圖8 酶解溫度對(duì)酶解液Lundin A、B和C區(qū)分分布的影響

結(jié)合圖8、圖9可見，在60、65℃酶解2 h階段，A、B區(qū)分的含量較高，但C區(qū)分產(chǎn)生量不多，聚集作用可能又使之減少，65℃時(shí)總含量小于60%，作為啤酒發(fā)酵液，將導(dǎo)致酵母細(xì)胞生長所需的α-氨基氮的含量過低，酵母生長不良，影響酒液的品質(zhì)。另外，在工廠條件下，一般溫度控制在45～55℃之間。綜上所述，考慮到蛋白質(zhì)回收率、水解度和A、B和C區(qū)分的相對(duì)分子質(zhì)量分布關(guān)系，選擇酶解溫度為55℃。

2.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大豆蛋白酶解產(chǎn)物的影響

酶量750 U/g，pH 8.0，酶解溫度55℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、5%、6%和7%下進(jìn)行酶解，滴加0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH在8.0。取不同時(shí)間段的酶解液測定其蛋白質(zhì)回收率、水解度(2.5 h)以及電泳后的相對(duì)分子質(zhì)量分布，結(jié)果見圖10和圖11。

圖11 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下隨反應(yīng)時(shí)間變化所得酶解液的SDS-PAGE圖譜

高底物濃度具有較高的酶解效率，對(duì)提高生產(chǎn)設(shè)備利用率有好處。但過高的底物濃度又造成酶解液黏度增大，影響蛋白酶的擴(kuò)散，降低水分活度，對(duì)酶解反應(yīng)有一定的抑制作用。由圖10可見，從蛋白質(zhì)回收率來看，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，蛋白質(zhì)回收率越低。因此，考慮到生產(chǎn)實(shí)際情況及蛋白質(zhì)回收率，選擇適中的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)是必要的。

圖10 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

由圖11可見，低底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下反應(yīng)在初始酶解階段，所得的多肽分布情況大致相似，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)提高以后，相對(duì)分子質(zhì)量高的肽類增加較多，酶解物的溶解性會(huì)變差，使發(fā)酵所得的啤酒的生物穩(wěn)定性降低。綜上，選擇酶解大豆蛋白的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，反應(yīng)時(shí)間為0.5～1.0 h。此時(shí)大豆蛋白酶解液為淺棕色，苦味稍重。

3 結(jié) 論

(1)通過單因素實(shí)驗(yàn)得知，Alcalase蛋白酶對(duì)大豆蛋白有很好的酶解作用。Alcalase蛋白酶酶解大豆蛋白制取復(fù)配酶解液的最佳條件為：酶解溫度55℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，酶量750 U/g，pH 8.0，反應(yīng)時(shí)間0.5～1.0 h。在最佳條件下所得的酶解液為淺棕色，苦味稍重，蛋白質(zhì)回收率約65%，所得到的酶解液的Lundin分布比較接近麥汁Lundin區(qū)分分布的要求。采用Alcalase蛋白酶制取啤酒糖漿的含氮復(fù)配液是可行的。

(2)復(fù)配糖漿可提高啤酒用糖漿有機(jī)含氮營養(yǎng)元素含量，在啤酒釀造中將具有更好的效果，具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。