閆學(xué)春，欒培賢，何立川

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

中華絨螯蟹Eriocheir sinensis（也稱河蟹）是我國特有的大型淡水蟹類，自然分布較廣，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，含有豐富維生素和礦物質(zhì)，蛋白質(zhì)的含量要高于魚肉和豬肉的幾倍，具有優(yōu)良的遺傳資源[1，2]。德國鏡鯉Cyprinus carpio L.是我國主要的淡水養(yǎng)殖魚類，應(yīng)用外源總DNA 直接導(dǎo)入法，將河蟹的這些有益的特定營養(yǎng)成分導(dǎo)入鏡鯉，對加速優(yōu)質(zhì)鏡鯉品種的選育，培育出適合消費(fèi)需求的多樣化優(yōu)質(zhì)鏡鯉養(yǎng)殖新品種具有重要意義[3]。對顯微介導(dǎo)河蟹總DNA 導(dǎo)入鏡鯉的檢測與分析已有報道[2]。顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)可以進(jìn)行常規(guī)育種方法難以完成的品種間，甚至更遠(yuǎn)的品種間的雜交，實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)移。

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，對淡水鯉科魚類肉質(zhì)的要求也在提高。提高低質(zhì)淡水鯉科魚類品質(zhì)是我國水產(chǎn)育種工作重要任務(wù)。而肌肉營養(yǎng)組成是評定魚類經(jīng)濟(jì)價值的重要指標(biāo)和了解其肉質(zhì)的最直接方法。利用外源總DNA 導(dǎo)入技術(shù)來提高動植物及其子代的氨基酸和蛋白等含量的研究已有過報道。如徐德昌等將大豆Glycine max（Linn.）Merr.基因組DNA 導(dǎo)入春小麥Triticum aestivum L.，獲得了蛋白含量高2 個百分點(diǎn)，清蛋白、球蛋白含量也明顯提高的一批可遺傳的變異株[4]；毛萬霞等利用花粉管通道法和兩種不同壓力基因槍法將大豆總DNA 導(dǎo)入大麥Hordeum vulgare L.，大麥后代籽粒的蛋白質(zhì)和必需氨基酸含量都有提高[5]；呂英海等采用基因槍法和花粉管通道法將大豆總DNA 直接導(dǎo)入大麥，提高了籽?？偘被岷透鞣N必需氨基酸含量[6]；閆學(xué)春等利用顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis 總DNA 導(dǎo)入鯉受精卵內(nèi)，提高了顯微介導(dǎo)中國明對蝦基因的鯉及其子代的蛋白質(zhì)和氨基酸含量[7,8]。本文通過分析顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉肌肉的營養(yǎng)成分，研究和比較這兩種鏡鯉的營養(yǎng)價值，發(fā)現(xiàn)顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉的蛋白和氨基酸含量高于普通鏡鯉，為超遠(yuǎn)緣分子雜交和創(chuàng)制鏡鯉新種質(zhì)技術(shù)提供了新方法和新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉取自本課題組生產(chǎn)的1 齡顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉F1代（以下簡稱實(shí)驗(yàn)魚）和普通鏡鯉（以下簡稱對照魚），各隨機(jī)取30尾，平均體質(zhì)量分別為234g 和227g。2 種魚的生長環(huán)境、飼養(yǎng)管理、飼料投喂等均相同。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

肌肉樣品采用冷鮮樣品。取實(shí)驗(yàn)魚與對照魚背部肌肉，去皮，將魚肉切成小塊、搗碎，用于測定蛋白質(zhì)和氨基酸含量。

1.2.2 常規(guī)營養(yǎng)成分測定

粗蛋白和氨基酸含量由農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（哈爾濱）測定。粗蛋白質(zhì)測定采用凱氏微量定氮法（國家標(biāo)準(zhǔn)：GB 5009.5-2010）；17 種氨基酸含量用鹽酸水解法（國家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 5009.124-2003），經(jīng)日立L-8800 型氨基酸自動分析儀測定。色氨酸在水解過程中被破壞沒有測定。

1.3 營養(yǎng)評價

實(shí)驗(yàn)魚的營養(yǎng)價值評價依據(jù)FAO/WHO 1973年建議的每克氮氨基酸評分標(biāo)準(zhǔn)模式和雞蛋蛋白模式進(jìn)行比較。氨基酸評分（Amino Acid Score,AAS）、化學(xué)評分（Chemical Score,CS）和必需氨基酸指數(shù)（Essential Amino Acid Index,EAAI）分別按下式計算[9-12]。

式中，n 代表比較的氨基酸數(shù)；tn代表實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)的氨基酸；sn代表雞蛋蛋白質(zhì)的氨基酸。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用t 檢驗(yàn)法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般營養(yǎng)成分

經(jīng)測定，顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉肌肉中粗蛋白質(zhì)含量為20.71%，比普通鏡鯉（18.32%）高13.05%，數(shù)理統(tǒng)計分析表明，沒有顯著差異（P＞0.061）（圖1）。

圖1 顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉F1代與普通鏡鯉的蛋白質(zhì)含量Fig.1 The contents of protein in F1generation of mirror carp with micro-injection Chinese mitten handed crab and common mirror carp

2.2 氨基酸組成

由表1 可知，顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉均含有17 種氨基酸，含量分別為78.94%和67.89%。兩種魚的谷氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸4 種鮮味氨基酸總量[13,14]分別為30.12%和25.86%，顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉總氨基酸含量和4 種鮮味氨基酸含量均高于普通鏡鯉。

圖2 F1代顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉的鮮味氨基酸含量Fig.2 The content of flavor amino acids in F1mirror carp generation with micro-injection Chinese mitten handed crab gene

由表2 可知，顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉中均含有7 種人體必需氨基酸（蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸），其含量分別占氨基酸總量的40.82%和41.02%，顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉必需氨基酸總含量比普通鏡鯉高15.69%。

2.3 氨基酸營養(yǎng)評價

表2 和表3 是分別將顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉和普通鏡鯉肌肉蛋白中氨基酸含量換算成每克氮中含氨基酸毫克數(shù)，再與蛋白質(zhì)評價的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)模式和雞蛋蛋白質(zhì)的氨基酸模式進(jìn)行比較，計算出兩種魚的氨基酸評分（AAS）、化學(xué)評分（CS）和必需氨基酸指數(shù)（EAAI）。

3 討論

3.1 顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉和普通鏡鯉肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分比較

蛋白質(zhì)含量是魚類營養(yǎng)價值的體現(xiàn)，是評價和建立魚類種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)之一[15-19]。而導(dǎo)入單個基因?qū)︳~類蛋白的影響已在唐魚Tanichthys albonubes 和鯉進(jìn)行研究。如樊佳佳和白俊杰在分析含有外源基因的轉(zhuǎn)紅色熒光蛋白基因唐魚的肌肉營養(yǎng)成分時，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因唐魚的粗蛋白質(zhì)含量高于非轉(zhuǎn)基因唐魚，但差異不顯著（P＞0.05）[20]；閆學(xué)春等[21]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)大麻哈魚Oncorhynchus keta 生長激素基因的鯉肌肉中蛋白質(zhì)含量稍高于非轉(zhuǎn)基因鯉，但無顯著差別（P＞0.05）；崔宗斌等[22]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)人Homo sapiens 生長激素基因F2代陽性紅鯉的蛋白質(zhì)含量顯著高于對照魚。在本研究中，顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉肌肉中粗蛋白質(zhì)含量為20.71%，比普通鏡鯉（18.32%）高13.05%，其原因可能是導(dǎo)入的外源基因是控制蟹類蛋白質(zhì)合成的某段基因，激活了鏡鯉的一些相關(guān)基因，導(dǎo)致顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉蛋白質(zhì)含量增高。至于是導(dǎo)入經(jīng)過遺傳修飾的單個基因，還是未經(jīng)遺傳修飾的外源總DNA 的導(dǎo)入會影響魚體內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解的代謝機(jī)制，還有待進(jìn)一步深入研究。目前，已報道，有多個信號通路參與了蛋白質(zhì)的合成與分解代謝過程。如泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway,UPP）是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白水平與功能的重要機(jī)制，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解[23-25]；而雷帕霉素靶蛋白（Target of Rapamycin,TOR）信號通路是控制蛋白質(zhì)合成的主要通路，TOR調(diào)控整體的翻譯水平，促進(jìn)細(xì)胞生長[26-28]。從本研究結(jié)果看，可能是導(dǎo)入的河蟹基因直接參與了這些信號通路，也有可能是間接調(diào)控這些通路中的關(guān)鍵酶，從而影響了顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉的蛋白質(zhì)組成，進(jìn)而促進(jìn)了蛋白質(zhì)含量的提高，當(dāng)然，影響顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉更為精細(xì)和復(fù)雜的代謝變化，值得繼續(xù)深入研究。

表1 顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉F1代與普通鏡鯉的肌肉中氨基酸含量（g/100g DW）Tab.1 The contents（g/100g DW）of amino acids in muscle of mirror carp F1generation with micro-injection Chinese mitten handed crab gene and common mirror carp

表2 F1代顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉肌肉必需氨基酸含量Tab.2 The contents of essential amino acids in muscles of F1generation of mirror carp with micro-injection Chinese mitten handed crab gene and common carp

表3 F1代顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉與普通鏡鯉的氨基酸評分、化學(xué)評分和必需氨基酸指數(shù)比較Tab.3 Comparison of amino acid score,chemical score and essential amino acid index in mirror carp with microinjection Chinese mitten handed crab gene and common carp

3.2 顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉氨基酸含量分析和營養(yǎng)價值評定

分析結(jié)果表明，顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉均含有17 種氨基酸（色氨酸除外），第一限制氨基酸都是纈氨酸，不同的是：顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉的第二限制氨基酸是蘇氨酸，而普通鏡鯉是蛋氨酸和胱氨酸。這與顯微介導(dǎo)中國對蝦基因的鯉的研究結(jié)果一致[7，8]。而第一限制氨基酸纈氨酸在顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉中含量要高于普通鏡鯉，且差異顯著，可以在蛋白質(zhì)營養(yǎng)上起到補(bǔ)缺作用。顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉的必需氨基酸占總氨基酸的40.82%，高于WHO/FAO 模式，低于雞蛋蛋白模式，而普通鏡鯉都低于這兩種模式。顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉肌肉的必需氨基酸指數(shù)分別為72.92 和62.68，其營養(yǎng)價值高于普通鯉。由表1 可知，天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸這4 種鮮味氨基酸在顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉肌肉中含量較高，達(dá)30.12%，比普通鏡鯉（25.86%）高，其中甘氨酸和丙氨酸差異顯著，其味道要比普通鏡鯉更鮮美。4 種鮮味氨基酸含量隨導(dǎo)入河蟹總DNA 的顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉總氨基酸含量的提高而升高，而其他必需氨基酸也會明顯提高，如蘇氨酸、纈氨酸，與普通鏡鯉比較，差異顯著。這表明利用顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)導(dǎo)入河蟹總DNA 還能夠全面提高鏡鯉的蛋白質(zhì)質(zhì)量，這對鏡鯉的品質(zhì)改良具有重要意義。

綜上所述，顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉肌肉營養(yǎng)成分的構(gòu)成種類一致，但是，含量上差異很大，特別是氨基酸含量。顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉肌肉營養(yǎng)成分高于普通鏡鯉，暗示了河蟹基因?qū)︼@微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉的蛋白質(zhì)合成與分解代謝產(chǎn)生了不可忽略的影響。通過顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)導(dǎo)入外源總DNA，可以進(jìn)行常規(guī)育種難以做到的種間雜交，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良性狀基因的轉(zhuǎn)移，彌補(bǔ)了優(yōu)異基因資源的缺乏，特別是與魚肌肉品質(zhì)相關(guān)的基因，本技術(shù)為解決在遠(yuǎn)緣甚至超遠(yuǎn)緣物種間多基因復(fù)雜性狀的轉(zhuǎn)移提供了很好的思路和方法。