張馳，劉飛，王萬良，周建設(shè)

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850000）

蘭格湖裸鯉Gymnocypris chui 隸屬鯉形目Cypriniformes鯉科 Cyprinidae 裂腹魚亞科Schizothoracinae，裸鯉屬Gymnocypris，主要分布于青藏高原海拔4 300m 以上的浪措、公珠措和瑪旁雍措等湖泊，極其適應(yīng)于青藏高原水域的生物和非生物條件，是青藏高原魚類三大類群之一[1]。蘭格湖裸鯉以底棲動(dòng)植物為食，在青藏高原淡水湖泊生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈中具有重要的地位。同其他高原魚類相似，蘭格湖裸鯉具有生長期短、生長緩慢、性成熟遲、以及繁殖力低等典型生物學(xué)特性。目前，關(guān)于蘭格湖裸鯉的研究主要集中在形態(tài)分類，對(duì)其功能基因的研究屬于空白。

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）又稱轉(zhuǎn)化生長因子（growth differentiation factor 8，GDF-8），是轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor β，TGF-β）超家族成員之一，對(duì)骨骼肌的生長具有負(fù)調(diào)控作用。Mcpherron 等[2]首先從小鼠Mus musculus 骨骼肌cDNA 文庫中克隆得到MSTN 基因，缺失該基因的小鼠與正常小鼠體重存在明顯差異。Grobet 等[3-5]發(fā)現(xiàn),牛Bos Taurus MSTN 基因外顯子存在自然缺失與變異，導(dǎo)致MSTN 活性消失，使肌肉增生。隨后Alexander 等[6]克隆出了人Homo sapiens、大鼠Rattus norvegicus、豬Sus scrofa、綿羊Ovis aries、雞Gallus gallus、狒狒Papio hamadryas 以及斑馬魚Danio rerio 等的cDNA 序列，發(fā)現(xiàn)脊椎動(dòng)物不同物種間MSTN 基因非常保守。

目前越來越多魚類[7-16]的MSTN 基因已被克隆出來，與其他動(dòng)物類似，魚類MSTN 基因都是由3個(gè)編碼分泌性N-端信號(hào)序列的外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子組成；內(nèi)含子-外顯子邊界都顯示了保守性，符合GT-AG 規(guī)則。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)：脊椎動(dòng)物中MSTN 有不同的轉(zhuǎn)錄本。Roberts 和Goetz[7]首次在大馬哈魚Oncorhynchus keta 不同組織里發(fā)現(xiàn)MSTN蛋白的2 個(gè)異構(gòu)體，二者在核酸水平的同源性為92%。Tong 等[8]在青海湖裸鯉Gymnocypris przewalskii 不同組織中也發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)錄本，各個(gè)組織廣泛表達(dá)MSTN1 型轉(zhuǎn)錄本，而MSTN2 型轉(zhuǎn)錄本僅在肌肉和腦組織中表達(dá)，兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在胚胎發(fā)育早期階段表達(dá)水平也有差異。

鑒于MSTN 基因?qū)?dòng)物肌肉生長發(fā)育的調(diào)控作用及其潛在的應(yīng)用價(jià)值，本研究通過克隆MSTN基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討蘭格湖裸鯉MSTN 基因結(jié)構(gòu)組成以及種間的遺傳分化，以期為高原湖泊魚類的遺傳資源保護(hù)、開發(fā)與利用提供分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘭格湖裸鯉采集于西藏自治區(qū)日喀則市昂仁縣浪措（29°12'33.45''N，87°23'5.46''E），又名蘭格湖，位于西藏自治區(qū)昂仁縣東南部。湖泊長軸呈東西向延伸，湖面海拔4 300m，長6 900m，最大寬2 300m，平均寬1 750m，面積約12.1km2。

2017 年7 月—2018 年5 月，以三層刺網(wǎng)（網(wǎng)目5cm）于浪措近岸水域采集蘭格湖裸鯉樣本15 尾，取魚鰭樣品，置于5mL 離心管中，75%酒精保存運(yùn)輸，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 浪措的地理位置Fig.1 The geographical position of the Langcuo

1.2 方法

1.2.1 DNA 的提取

取尾鰭樣品約20mg，剪碎或者置于有液氮的研缽中磨碎，然后置于1.5mL 離心管中。用OMEGA DNA tissue kit 試劑盒，按照說明書步驟提取總DNA。

1.2.2 MSTN 基因PCR 擴(kuò)增和測(cè)序

根據(jù)GenBank 注釋的青海湖裸鯉的MSTN 基因序列（序列號(hào)：KP277104），設(shè)計(jì)4 對(duì)引物（表1），以基因組DNA 為模板擴(kuò)增蘭格湖裸鯉MSTN 基因序列，PCR 擴(kuò)增引物由上海生工合成。PCR 12.5μL反應(yīng)體系為6×Master Mix 6.25μL，dd H2O 4.75μL，上下游引物各0.25μL，DNA 模板1μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變 性5min；94℃變性30s；62℃退火30s；72℃延伸30s；共計(jì)35 個(gè)循環(huán)；最后72℃繼續(xù)延伸5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳采用紫外成像儀拍照。

表1 蘭格湖裸鯉MSTN 基因克隆及分析引物Tab.1 Primers for MSTN clone and analysis in Gymnocypris chui

1.2.3 PCR 產(chǎn)物的回收、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序

用OMEGA Gel Extraction Kit DNA 凝膠回收試劑盒回收純化PCR 產(chǎn)物，具體步驟按照說明書操作?；厥盏腄NA 在T4 連接酶的作用下，16℃4h，連接到T-載體pMD18-T 上（TaKaRa 公司）。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用DNAMAN 8.0（https://www.lynnon.com）軟件進(jìn)行基因序列拼接；在線使用Blastx 程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行基因序列相似性搜索；MEGA7.0 軟件構(gòu)建鄰接（Neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹[9]；DNAstar7.1 進(jìn)行序列組成及遺傳變異位點(diǎn)分析（https://www.dnastar.com）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭格湖裸鯉MSTN 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

從蘭格湖裸鯉鰭條樣本中提取出完整的基因組DNA，用MSTN 基因4 對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到特異性條帶，產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2 所示。將測(cè)序所得序列比對(duì)后，得到MSTN-1a 的長度為1101bp，MSTN-1b 為1 179bp，MSTN-2a 為1 111bp，MSTN-2b 為908bp，4 條序列均去除了兩端引物且與目的片段大小基本相同。

圖2 PCR 擴(kuò)增目的條帶電泳圖Fig.2 Electrophoresis map of amplification of the purpose bands by PCR

2.2 蘭格湖裸鯉MSTN 基因結(jié)構(gòu)

利用DNAMAN 軟件對(duì)4 對(duì)引物的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，獲得長為3 526bp 的蘭格湖裸鯉MSTN 基因序列，并分析了其堿基組成A（29.6%）；C（21.7%）；G（20.6%）；T（28.1%）。采用比較基因組方法與青海湖裸鯉MSTN 基因的mRNA 序列進(jìn)行比較，確定蘭格湖裸鯉MSTN 基因結(jié)構(gòu)。蘭格湖裸鯉MSTN 基因序列，包含該基因的全部外顯子和內(nèi)含子序列以及部分5'-側(cè)翼區(qū)、3'-側(cè)翼區(qū)序列。蘭格湖裸鯉MSTN 基因結(jié)構(gòu)與人、牛、山羊、小鼠、雞等各物種相同，均由3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子組成，內(nèi)含子剪接符合GT-AG 法則。其中，3 個(gè)外顯子大小分別為376bp、71bp 和381bp，外顯子Ⅰ包含起始密碼子ATG，外顯子Ⅲ含有終止密碼子TGA；內(nèi)含子Ⅰ和內(nèi)含子Ⅱ大小分別為665bp 和912bp。使用DNASTAR 軟件對(duì)蘭格湖裸鯉MSTN 基因與其他物種的MSTN 基因序列進(jìn)行比較分析，確定該基因CDS 序列全長為1 128bp，編碼375 個(gè)氨基酸，Gen-Bank 序列號(hào)MK497253。

表2 物種信息表Tab.2 Summary of species used in this study

2.3 蘭格湖裸鯉MSTN 基因CDS 序列種間相似性分析

將蘭格湖裸鯉MSTN 基因全編碼區(qū)核苷酸序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的青海湖裸鯉、黃河裸裂尻、鯉、金線鲃、斑馬魚、大西洋鮭、蘭州鲇、人、小鼠、牦牛和豬等11 個(gè)物種相應(yīng)基因序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，計(jì)算不同物種編碼序列間的相似性（表2）。由表2 可知，蘭格湖裸鯉與青海湖裸鯉、黃河裸裂尻間相似性最高，均為98.9%。兩種裸鯉MSTN 基因的基因編碼區(qū)中存在12 個(gè)差異位點(diǎn)，其中5 個(gè)位點(diǎn)（11bp、236bp、795bp、838bp 和1 011bp）處存在AG 堿基轉(zhuǎn)換；5 個(gè)位點(diǎn)（432bp、477bp、924bp、942bp和1 065bp）發(fā)生了TC 堿基轉(zhuǎn)換；兩個(gè)位點(diǎn)（614bp和930bp）處發(fā)生了GT 堿基顛換。這些堿基變異導(dǎo)致這兩種裸鯉該基因的4 個(gè)位點(diǎn)編碼蛋白產(chǎn)生差異。除了與同為裂腹魚亞科的兩種魚最為相似外，蘭格湖裸鯉與鯉、大鱗副泥鰍、斑馬魚、大西洋鮭、蘭州鲇、人、小鼠、牦牛和豬的種間相似性依次為97.0%、93.1%、89.8%、80.5%、77.5%、65.1%、64.9%、64.6%和63.6%，結(jié)果與生物進(jìn)化的歷程相一致，說明該基因在物種間保守性很強(qiáng)，可能是影響生物進(jìn)化、生長發(fā)育的重要因子。

2.4 蘭格湖裸鯉與其他5 種鯉科魚類MSTN 基因氨基酸序列間比較分析

利用DNASTAR 軟件將獲得的蘭格湖裸鯉MSTN 編碼序列轉(zhuǎn)換成氨基酸序列，并與NCBI 數(shù)據(jù)庫的青海湖裸鯉、黃河裸裂尻、鯉、斑馬魚和大鱗副泥鰍的氨基酸序列進(jìn)行排列比較（圖3），計(jì)算氨基酸序列之間的相似性，分別為99.2%、98.9%、96.5%、94.7%和93.1%，裂腹魚亞科的3 種魚類氨基酸序列相似性明顯高于其他物種。

2.5 蘭格湖裸鯉MSTN 基因系統(tǒng)發(fā)育分析

基于蘭格湖裸鯉MSTN 編碼序列和GenBank公布的其他物種的相應(yīng)序列，通過MEGA7 基于最大似然法參數(shù)模型，用NJ 法構(gòu)建了12 種脊椎動(dòng)物MSTN 基因系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。從圖4 中可以看出，系統(tǒng)發(fā)育樹將脊椎動(dòng)物分成2 個(gè)主要族群，魚類與哺乳動(dòng)物分別聚成一支。蘭格湖裸鯉等3 種裂腹魚亞科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與其地理分布區(qū)系相一致。

3 討論

MSTN 基因已受到動(dòng)物遺傳育種研究者的廣泛關(guān)注，相繼克隆了牛、羊、豬、雞、大黃魚Larimichthys crocea、羅非魚Oreochromis niloticus[10-14]等多種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的MSTN 基因，研究了該基因功能[15-17]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是近幾年研究較多的基因編輯工具，以MSTN 基因?yàn)榘形稽c(diǎn)，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)獲得了豬、牛、羊、兔等多種基因編輯動(dòng)物[18-21]。遺傳修飾可以加速改良物種的生長性狀、抗病性能和肉質(zhì)品質(zhì)，可以進(jìn)行MSTN 基因的敲除或者人工突變，獲得MSTN 基因修飾的魚類新品種。

本研究克隆了蘭格湖裸鯉的MSTN 基因，獲得了該基因1 128bp 的CDS 全序列，通過比較基因組和生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)和分析MSTN 基因編碼產(chǎn)物，為揭示蘭格湖裸鯉MSTN 基因的遺傳特性提供了有價(jià)值的理論依據(jù)。本研究獲得的蘭格湖裸鯉MSTN 基因結(jié)構(gòu)與鯉科魚類的結(jié)構(gòu)基本一致，均包含3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)包含1 128 個(gè)核苷酸，共編碼375 個(gè)氨基酸，其中前22 個(gè)氨基酸為MSTN 的信號(hào)肽。不同科魚類物種間MSTN 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物差異較大，而在哺乳動(dòng)物中MSTN 基因卻相當(dāng)保守，魚類MSTN 基因的表達(dá)方式可能與哺乳類動(dòng)物不同。

表3 蘭格湖裸鯉與11 個(gè)物種間MSTN 基因核苷酸序列編碼區(qū)相似性Tab.3 Homology of nucleotide sequences of encoding region of MSTN gene between Gymnocypris chui and other 11 species

圖4 基于MSTN 基因編碼序列構(gòu)建的部分脊椎動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of representative vertebrates based on MSTN CDS sequences

序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，蘭格湖裸鯉MSTN 與鯉科魚類，尤其是裂腹魚亞科的魚類同源性較高，與鲇魚形目魚類的同源性次之，與哺乳動(dòng)物的同源性最低，這與Song 等[22]的研究結(jié)果相一致。MSTN 基因種間分化明顯，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與傳統(tǒng)動(dòng)物進(jìn)化分類相一致，不同物種的MSTN 序列同源性基本反應(yīng)了它們的親緣關(guān)系，符合物種的分子進(jìn)化理論。

本研究成功克隆了蘭格湖裸鯉MSTN 基因序列，分析其基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為進(jìn)一步開展蘭格湖裸鯉MSTN 基因的表達(dá)調(diào)控、進(jìn)化和多態(tài)性研究奠定基礎(chǔ)。