余 巧，馮白茹，申 茹，李大煒，徐英輝，祁銀德

（惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 惠州 516025）

半夏瀉心湯源自《傷寒論》，由半夏、黃芩、黃連、干姜、人參、炙甘草、大棗7 味藥材組成，可辛開苦降、散結(jié)消痞，主治寒熱錯(cuò)雜之痞證。大量研究表明［1-7］，半夏瀉心湯是現(xiàn)代疾?。ㄈ缏晕秆?、胃潰瘍、慢性結(jié)腸炎、功能性消化不良，潰瘍性結(jié)腸炎等）臨床常用的基礎(chǔ)方，但存在煎煮耗時(shí)、服用麻煩、不易攜帶和長時(shí)間貯存的缺點(diǎn)；保留灌腸治療時(shí)，藥液又受體位因素影響而難以充分接觸所有受損腸黏膜，而且操作麻煩，患者舒適度差。因此，本實(shí)驗(yàn)將半夏瀉心湯開發(fā)成結(jié)腸靶向片，不僅能避免湯劑、灌腸劑的缺點(diǎn)，還可直接將藥物運(yùn)送到病灶部位來發(fā)揮療效，為臨床治療腸道疾病提供了新劑型。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；RE-3000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；B00Y 高速多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；JA3003 電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；TDP-6 單沖式壓片機(jī)（吉首市中誠制藥機(jī)械廠）；BZF-50 真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；BPG-9240A鼓風(fēng)干燥箱（上海百典儀器設(shè)備有限公司）；BY300 A 小型包衣機(jī)（上海黃海藥檢儀器有限公司）；RC-6D 溶出度測試儀（天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥 黃芩苷（批號(hào)BWB50476 170421）、鹽酸小檗堿（批號(hào)BWB50137 170113）對(duì)照品（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，含有量≥98%）。甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物（Eudragit S100，德國Evonik Rohm GmbH 公司，批號(hào)B170105202）。半夏、黃芩、黃連、干姜、人參、炙甘草、大棗均購于北京同仁堂惠州藥店有限責(zé)任公司，經(jīng)惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥教研室祁銀德副教授鑒定為正品。藥用微晶纖維素（SH-CG1，安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號(hào)171103）；交聯(lián)聚維酮（ISP XL，合肥巴斯夫生物科技有限公司，批號(hào)BSF180610）；滑石粉（鄭州宏升滑石制品有限公司）；鄰苯二甲酸二乙酯（上海麥克林生化科技有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材提取

2.1.1 煎煮法 稱取處方量（法半夏12 g、黃連3 g、黃芩9 g、干姜9 g、人參9 g、炙甘草9 g、大棗3 枚）藥材粗粉，第1 次以8 倍量純化水煎煮1 h，第2 次以6 倍量純化水煎煮1 h，濾過，合并濾液，定容至500 mL 備用。

2.1.2 浸漬法 稱取處方量藥材粗粉，加14 倍量70%乙醇浸漬72 h，濾過，濾液定容至500 mL備用。

2.1.3 回流法 稱取處方量藥材粗粉，第1 次加8 倍量70% 乙醇回流提取1 h，第2 次加6 倍量70%乙醇回流提取1 h，濾過，合并濾液，定容至500 mL 備用。

2.1.4 滲漉法 稱取處方量藥材粗粉，加2 倍量70%乙醇拌勻，潤濕，裝筒，浸漬24 h，再以12倍量70%乙醇滲漉，速度3 mL／（min·kg），滲漉液定容至500 ml，備用。

2.1.5 結(jié)果分析 將“2.1.1”～“2.1.4”項(xiàng)下濾液進(jìn)樣測定，按下式計(jì)算黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量；前期實(shí)驗(yàn)顯示，黃芩苷提取率較高，故評(píng)分時(shí)設(shè)定其權(quán)重為0.75，而鹽酸小檗堿為0.25，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見表1。最終，選擇滲漉法進(jìn)行提取。

表1 提取方法考察結(jié)果Tab.1 Results of extraction method investigation

2.2 正交試驗(yàn) 以粉碎度（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、乙醇用量（C）、滲漉速度（D）為影響因素，采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，因素水平見表2，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of tests

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

由此可知，各因素對(duì)綜合評(píng)分都有顯著影響（P＜0.01），程度依次為A ＞B ＞D ＞C，即粉碎度、乙醇體積分?jǐn)?shù)影響較大，滲漉速度次之，乙醇用量最小。最終，確定最優(yōu)提取工藝為A2B2C2D1，即藥材粉碎成粗粉后加10 倍量70% 乙醇，以2～3 mL／（min·kg）速度進(jìn)行滲漉。

然后，將處方量藥材放大10 倍，按優(yōu)化工藝進(jìn)行滲漉提取，進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表5，可知工藝穩(wěn)定可行。

2.3 結(jié)腸靶向片制備

2.3.1 片芯 取處方藥材粗粉（法半夏120 g、黃連30 g、黃芩90 g、干姜90 g、人參90 g、炙甘草90 g、大棗30 枚），按優(yōu)化工藝滲漉，滲漉液回收乙醇后濃縮成浸膏（相對(duì)密度1.35，黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量分別為74.18、12.55 mg／g）。取浸膏200 g，加入輔料（微晶纖維素∶淀粉=3∶1）100 g，60 ℃下干燥，粉碎，加入適量95%乙醇，14目篩濕法制粒，濕顆粒于60 ℃下干燥后用14 目篩整粒，再加入總顆粒量3%交聯(lián)聚維酮、1%微晶纖維素、1%滑石粉，壓片，片重（0.80±0.04）g，黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量分別為48.5、8.6 mg／g。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（Ⅰ， n=3）Tab.5 Results of verification tests（Ⅰ， n=3）

2.3.2 包衣液 將Eudragit S100 分散于95%乙醇中形成均勻膠體溶液，加入鄰苯二甲酸二乙酯、滑石粉，再加95%乙醇至100 mL，攪拌混勻。將片芯置包衣鍋中（傾角45°），轉(zhuǎn)速30～35 r／min，鼓入熱風(fēng)（溫度40～50 ℃），預(yù)熱，包衣，即得。

2.4 黃芩苷含有量測定

2.4.1 色譜條件 LiChrospher C18色譜柱（4.0 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-0.1% 磷酸（47∶53）；檢測波長280 nm；柱溫25 ℃；體積流量0.8 mL／min；進(jìn)樣量10 μL。

2.4.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，甲醇溶解，制成每1 mL 含1.10 mg 該成分的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液制備 結(jié)腸靶向片除去包衣，研細(xì)，精密稱取約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入20 mL 甲醇，超聲（功率250 W、頻率30 kHz）30 min，放冷，甲醇定容于25 mL 量瓶，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 陰性樣品溶液制備 取除黃芩以外的藥材制成結(jié)腸靶向片，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4.5 專屬性考察 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測定，結(jié)果見圖1。由圖可知，供試品、對(duì)照品均能得到較好的分離，陰性無干擾。

圖1 黃芩苷HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of baicalin

2.4.6 線性關(guān)系考察 對(duì)照品溶液依次稀釋至11、22、55、110、220、550 μg／mL，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測定。以黃芩苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程Y=41.887X-113.37（r=0.999 9），在11～550 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得黃芩苷含有量RSD 為1.40%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得黃芩苷峰面積RSD 為1.36%，表明儀器精密度良好。

2.4.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6 份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得黃芩苷含有量RSD為1.50%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.10 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的樣品9份，加入低、中、高3 個(gè)水平的對(duì)照品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測定，測得黃芩苷平均加樣回收率分別為100.69%、101.70%、100.17%，RSD 分別為2.38%、2.45%、1.26%。

2.5 鹽酸小檗堿含有量測定

2.5.1 色譜條件 LiChrospher C18色譜柱（4.0 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.05 mol／L磷酸二氫鉀（30∶70，磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.0）；檢測波長345 nm；柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL／min；進(jìn)樣量10 μL。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，甲醇溶解，制成每1 mL 含0.4 mg 該成分的溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液制備 同“2.4.3”項(xiàng)。

2.5.4 陰性樣品溶液制備 取除黃連以外的藥材制成結(jié)腸靶向片，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5.5 專屬性考察 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測定，色譜圖見圖2。由圖可知，供試品、對(duì)照品均能得到較好的分離，陰性無干擾。

圖2 鹽酸小檗堿HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of berberine hydrochloride

2.5.6 線性關(guān)系考察 鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液依次稀釋至2、8、20、40、80、160 μg／mL，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測定。以鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得方程Y=24.428X-51.774（r=0.999 9），在2～160 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸小檗堿含有量RSD 為1.44%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得鹽酸小檗堿峰面積RSD 為1.74%，表明儀器精密度良好。

2.5.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6 份，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸小檗堿含有量RSD 為1.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.10 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的樣品9份，加入低、中、高3 個(gè)水平的對(duì)照品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，測得鹽酸小檗堿平均加樣回收率分別為102.85%、101.73%、100.90%，RSD 分別為1.17%、2.22%、2.63%。

2.6 體外釋放度評(píng)價(jià)及包衣處方篩選

2.6.1 體外釋放度 按2015 年版《中國藥典》四部0931 溶出度與釋放度測定法中第三法（即小杯法）［8］，轉(zhuǎn)速70 r／min，溫度（37±0.5）℃，溶出液體積150 mL，測定介質(zhì)和時(shí)間分別為0.1 mol／L鹽酸2 h、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液［9］4 h、pH 7.8～8.0 磷酸鹽緩沖液［9］1 h。在介質(zhì)轉(zhuǎn)換時(shí)間點(diǎn)將前一介質(zhì)傾出，然后加入溫度（37±0.5）℃的后一種介質(zhì)，繼續(xù)進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)，不同溶出介質(zhì)更換應(yīng)于5 min 內(nèi)完成［10］。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取樣1 mL，過0.45 μm 微孔濾膜，同時(shí)補(bǔ)充同溫同體積新鮮介質(zhì)，HPLC 法測定黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量，計(jì)算累積釋放度。

2.6.2 增塑劑用量 選擇鄰苯二甲酸二乙酯作為增塑劑，按表6 處方配制包衣液，使片芯增重8%，測定體外釋放度，結(jié)果見表7。由表可知，當(dāng)鄰苯二甲酸二乙酯用量為0.4%時(shí)（處方1），藥片在人工小腸液中4 h 后衣膜出現(xiàn)裂縫，黃芩苷、鹽酸小檗堿體外累積釋放率分別為10.1%、9.2%，泄漏較多；為0.6%、0.8%（處方2、3）時(shí)，包衣片在小腸液中衣膜完整無裂縫，藥物泄露較少。因此，選擇處方2，即鄰苯二甲酸二乙酯用量為0.6%。

表6 包衣處方Tab.6 Coating formulations

表7 增塑劑用量對(duì)各成分體外釋放度的影響（%）Tab.7 Effects of plasticizer consumption on the in vitro release rates of various constituents（%）

2.6.3 包衣增重 按表6 中的處方2 稱取適量Eudragit S100、鄰苯二甲酸二乙酯、滑石粉，制備包衣液，使片芯分別增重6%、8%、10%，測定體外釋放度，結(jié)果見表8。由表可知，在人工胃液中釋放2 h 后包衣片均無藥物釋放；包衣增重為8%時(shí)，包衣片在人工小腸液中4 h 后泄露不明顯，而在人工結(jié)腸液中1 h 后黃芩苷、鹽酸小檗堿累積釋放率明顯高于包衣增重10%，分別達(dá)到89.1%、86.4%。因此，選擇包衣增重為8%。2.6.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下工藝制備3 批結(jié)腸靶向片，測定體外釋放度，結(jié)果見表9，可知樣品均具有結(jié)腸定位釋藥性能，而且基本穩(wěn)定。

表8 包衣增重對(duì)各成分體外釋放度的影響（%）Tab.8 Effects of coating weight gain on the in vitro release rates of various constituents（%）

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（Ⅱ， n=3，%）Tab.9 Results of verification tests（Ⅱ， n=3，%）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用滲漉法作為半夏瀉心結(jié)腸靶向片最佳提取工藝，并且發(fā)現(xiàn)藥材粉碎成中粉時(shí)，很容易堵塞孔隙而妨礙溶劑通過，滲漉液不能順利流出，導(dǎo)致操作困難，提取率也很低，故選擇粉碎度為粗粉。

口服結(jié)腸靶向給藥是指通過藥物傳輸系統(tǒng)口服給藥后，藥物不在上消化道釋放，而是到達(dá)人體回盲部后才開始崩解或溶出［11-13］。目前，pH 依賴型結(jié)腸包衣常用的材料為丙烯酸樹脂類，其中Eudragit S100 在pH＞7.0 時(shí)包衣層開始溶解，可達(dá)到結(jié)腸釋藥的目的，故選擇其作為包衣材料進(jìn)行結(jié)腸包衣［14-15］。

包衣液濃度、增塑劑用量、包衣增重等是達(dá)到理想包衣效果的關(guān)鍵因素，其中包衣液濃度不能太大，否則在包衣過程中容易出現(xiàn)黏連現(xiàn)象，可適當(dāng)添加滑石粉；添加增塑劑可提高包衣膜柔韌性，但其用量過大也會(huì)影響指標(biāo)成分在人工結(jié)腸液中的釋放；包衣增重過少，包衣層不能完全覆蓋片芯，導(dǎo)致藥物提前釋放，而過多時(shí)包衣層太厚，導(dǎo)致溶解緩慢，藥物難以釋放出來。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所制備的半夏瀉心結(jié)腸靶向片在人工胃液中無釋放，人工腸液中黃芩苷、鹽酸小檗堿累積溶出度均小于5%，人工結(jié)腸液中1 h 后兩者均達(dá)85% 以上，符合結(jié)腸靶向片要求。同時(shí)，驗(yàn)證試驗(yàn)也印證了提取方法和包衣工藝穩(wěn)定可行，可為后期中藥新劑型研發(fā)提供理論依據(jù)。