趙惠茹，石大玉，靖 會(huì)，肖 呈，周 喆，張一帆

（西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021）

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，為臨床常用中藥，具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒的功效［1］，其總黃酮有抗氧化、抗炎、抗心律失常、抑菌、保肝等作用［2-3］，但其水溶性差，相關(guān)口服制劑（金銀花糖漿、復(fù)方金銀花顆粒等）生物利用度低，從而限制藥效發(fā)揮，影響臨床應(yīng)用。文獻(xiàn)［4-6］報(bào)道，將金銀花總黃酮制成自微乳可能會(huì)提高其水溶性，但目前尚無相關(guān)研究。

自微乳是由油相、乳化劑、助乳化劑組成的一種新型藥物載體，在溫和攪拌下遇水可自乳化成粒徑小于100 nm 的水包油型乳劑，在增加難溶性藥物溶解度、促進(jìn)藥物吸收、提高生物利用度、避免藥物水解和對(duì)胃腸道不良刺激方面具有明顯優(yōu)勢，近年來已廣泛用于藥物制劑開發(fā)中［7-8］。其中，篩選處方是最核心的部分，故本實(shí)驗(yàn)擬將金銀花總黃酮制成自微乳，并采用單純形網(wǎng)格法優(yōu)化其處方，為相關(guān)新劑型研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 ZEN3600 型激光粒度儀（英國Malvern公司）；UV762 型紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA1004B 型電子精密天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16C型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥 蘆丁對(duì)照品（含有量≥99%，批號(hào)100080，上海源葉生物科技有限公司）；金銀花總黃酮（批號(hào)180326，自制，以蘆丁計(jì)算含有量為74.6%）。金銀花購于西安市萬壽路藥材市場，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院邊軍昌高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾。D101 大孔吸附樹脂（陜西藍(lán)深科技有限公司）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH-40）、聚氧乙烯蓖麻油（EL-35）（德國巴斯夫公司）；曲拉通（X-100，成都市科龍化工試劑廠）；吐溫-80（天津富宇精細(xì)化工有限公司）；辛酸癸酸三甘油酯（上海千為油脂科技有限公司）；肉豆蔻酸異丙酯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；油酸乙酯（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；聚乙二醇400（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；1，2-丙二醇（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）；異丙醇（天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）。其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含有量測定［9］精密稱取蘆丁對(duì)照品20.0 mg，置于50 mL 量瓶中，70%乙醇溶解定容，得0.400 mg／mL 對(duì)照品溶液，精密移取0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，置于10 mL量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉0.4 mL，搖勻，靜置6 min；10%硝酸鋁0.4 mL，搖勻，靜置6 min；4%氫氧化鈉4 mL，加水定容至刻度，搖勻，靜置15 min，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，在510 nm 波長處測定吸光度。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A=4.366 1X+0.011 3（r=0.997 1），在0.04～0.16 mg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 總黃酮制備

2.2.1 提?。?0］稱取藥材粗粉適量，置于索氏提取器中，石油醚連續(xù)回流至提取液無色后取出晾干，加入10、8、6 倍量70% 乙醇回流提取3 次，每次1.5 h，提取液合并，減壓濃縮至無醇味，6倍量蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓?2 h 后離心，上清液減壓濃縮至適當(dāng)濃度，備用。

2.2.2 純化［11-12］將預(yù)處理好的D101 大孔吸附樹脂倒入燒杯中，加入總黃酮濃縮液靜態(tài)吸附12 h，將達(dá)到吸附飽和的樹脂裝入層析柱中，依次用6 BV 蒸餾水、5 BV 30%乙醇洗脫除去雜質(zhì)，再用5 BV 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，即得總黃酮。精密稱取干燥至恒重的總黃酮50 mg，置于25 mL 量瓶中，70%乙醇溶解定，精密移取2.0 mL 置于25 mL 量瓶中，按“2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，測得總黃酮含有量為74.6%。

2.3 處方篩選

2.3.1 溶解度 精密稱取聚氧乙烯氫化蓖麻油RH-40、曲拉通X-100、聚氧乙烯蓖麻油EL-35、吐溫-80 這4 種乳化劑，以及異丙醇、聚乙二醇400、1，2-丙二醇、無水乙醇這4 種助乳化劑各4 g，置于具塞離心管中，加入過量總黃酮，在20 kHz頻率、室溫下超聲1 h 輔助溶解后37 ℃水浴中靜置24 h，3 000 r／min 離心10 min，吸取適量上清液，甲醇稀釋至適宜濃度，按“2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算溶解度，結(jié)果見表1。由表可知，總黃酮在聚氧乙烯氫化蓖麻油RH-40、吐溫-80、無水乙醇、1，2-丙二醇中的溶解度較大，故選擇前兩者作為乳化劑，后兩者作為助乳化劑進(jìn)一步篩選自微乳油相。

表1 總黃酮溶解度測定結(jié)果Tab.1 Results of solubility determination of total flavonoids

2.3.2 油相與乳化劑配伍 將辛酸癸酸三甘油酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸乙酯這3 種油相與聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40、吐溫-80 這2 種乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6 比例混合后，加入100 倍量超純水，400 r／min 磁力攪拌，按文獻(xiàn)［13］方法根據(jù)乳化時(shí)間和液體顏色觀察乳化情況。結(jié)果，油酸乙酯與吐溫-80 配伍時(shí)乳化時(shí)間短，所需乳化劑少，乳化效果好，故選擇前者作為油相，后者作為乳化劑。

2.3.3 助乳化劑 按照油酸乙酯、吐溫-80、助乳化劑2∶4∶4 的比例加入助乳化劑無水乙醇、1，2-丙二醇，400 r／min 磁力攪拌均勻后加入100 倍量超純水磁力攪拌乳化，記錄從加入超純水開始磁力攪拌至完全分散、形成外觀澄清或有藍(lán)白色乳光均一微乳所需的時(shí)間，即為乳化時(shí)間。結(jié)果，加入2 種助乳化劑后乳化時(shí)間均分別縮短至24、37 s，考慮到無水乙醇易揮發(fā)，故選擇1，2-丙二醇作為助乳化劑。

2.3.4 各組分比例范圍［14］先將吐溫-80 與1，2-丙二醇按照1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 比例混勻，再與油酸乙酯按照9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5 比例混勻后，稱取0.5 g 滴加到50 mL 超純水中，400 r／min 磁力攪拌，記錄可形成外觀澄清或有藍(lán)白色乳光的均一微乳處方中各組分比例。再以油相、乳化劑、助乳化劑為相圖3 個(gè)頂點(diǎn)，Origin8.0 軟件繪制偽三元相圖，結(jié)果見圖1，根據(jù)微乳區(qū)域的邊界確定油酸乙酯、吐溫-80、1，2-丙二醇比例范圍分別為10%～30%、30%～70%、10%～50%。

2.4 處方優(yōu)化

圖1 自微乳偽三元相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram for self-microemulsions

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)［15-17］根據(jù)“2.3”項(xiàng)下處方篩選結(jié)果，結(jié)合單純形網(wǎng)格法比例約束，確定自微乳中各組分比例為油酸乙酯（X1）10%～25%、吐溫-80（X2）45%～60%、1，2-丙 二 醇（X3）30%～45%。再以自微乳平均粒徑（Y1）、多分散指數(shù)（Y2）、載藥量（Y3）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，按處方比例精密稱取油相、乳化劑、助乳化劑，400 r／min 磁力攪拌10 min后加入過量總黃酮，混勻，在20 kHz 頻率、室溫下超聲1 h 輔助溶解，靜置24 h，即得自微乳。過濾后，精密稱取0.5 g 置于50 mL 量瓶中，超純水稀釋并定容，搖勻，3 000 r／min 離心10 min，移取適量上清液，測定平均粒徑、多分散指數(shù)，按“2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算載藥量，公式為載藥量=總黃酮質(zhì)量／自微乳質(zhì)量，結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

2.4.2 模型擬合及方差分析 通過Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行多元回歸模型擬合，得方程分別為Y1=-77.772 60X1-77.945 24X2-19.639 91X3+11.678 00X1X2+5.708 27X2X3+20.655 94X1X3-0.441 59X1X2X3、Y2=-0.005 48X1+0.012 17X2-0.004 11X3、Y3=-0.051 34X1-0.072 01X2+0.197 74X3。再進(jìn)行方差分析，可知各模型P＜0.000 1，失 擬 項(xiàng)P＞0.05，回 歸 方 程 系 數(shù)R2＞0.80，表明模型擬合度良好。

2.4.3 響應(yīng)面分析 見圖2。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 自微乳粒徑越小，粒徑分布越窄，越有利于藥物的溶出與吸收；載藥量越大，實(shí)際服用劑量越少，越便于臨床應(yīng)用。因此，綜合考慮3個(gè)指標(biāo)，以平均粒徑、多分散指數(shù)符合要求并盡可能小，載藥量最大為指標(biāo)，Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行優(yōu)化，得最優(yōu)處方為油酸乙酯、吐溫-80、1，2-丙二醇比例10∶45∶45。再根據(jù)優(yōu)化處方制備3 批自微乳，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表3、圖3，可知處方穩(wěn)定可行。

3 討論

圖3 自微乳粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of self-microemulsions

本實(shí)驗(yàn)采用D101 大孔吸附樹脂分離純化金銀花總黃酮時(shí)，依次用適量純化水和30%乙醇除雜，再用70%乙醇洗脫，發(fā)現(xiàn)純度較高，粒徑較預(yù)實(shí)驗(yàn)沒有除雜所得的自微乳減小，載藥量顯著增大，說明理化性質(zhì)差別較大的雜質(zhì)會(huì)對(duì)其形成產(chǎn)生特殊影響。因此，在對(duì)中藥有效部位自微乳處方進(jìn)行研究時(shí)，應(yīng)盡可能采用多種純化方法提高其純度。

本實(shí)驗(yàn)首先根據(jù)金銀花總黃酮在幾種備選乳化劑、助乳化劑中的溶解度初步篩選，然后通過油相、乳化劑的配伍實(shí)驗(yàn)來確定種類，接著篩選助乳化劑，根據(jù)偽三元相圖確定各自比例范圍，最后用單純形網(wǎng)格法進(jìn)一步優(yōu)化。這與測定總黃酮在各種備選油相、乳化劑、助乳化劑中的溶解度來篩選處方不同，主要是因?yàn)榧词箍傸S酮在某種油相中的溶解度最大，與乳化劑、助乳化劑配伍后未必是最優(yōu)處方，甚至有時(shí)候并不能形成穩(wěn)定的微乳，還需要進(jìn)一步選擇溶解度次之的油相去配伍。為了減少油相、乳化劑、助乳化劑配伍次數(shù)，避免盲目性篩選，本實(shí)驗(yàn)略去了總黃酮在各種備選油相中的溶解度數(shù)據(jù)。

由于金銀花總黃酮在無水乙醇中的溶解度大于1，2-丙二醇，故預(yù)實(shí)驗(yàn)以其為助乳化劑，偽三元相圖微乳區(qū)域各組分的比例分別為10%～40%油酸乙酯、30%～80% 吐溫-80、10%～60% 無水乙醇，但用單純形網(wǎng)格法優(yōu)選時(shí)有個(gè)別處方不能形成穩(wěn)定的微乳，可能是由于攪拌時(shí)無水乙醇揮發(fā)，從而使各組分比例發(fā)生變化，降低了穩(wěn)定性，故選用對(duì)金銀花總黃酮溶解能力較好、不揮發(fā)的1，2-丙二醇作為助乳化劑。另外，采用單純形網(wǎng)格法優(yōu)選處方時(shí)，14 組實(shí)驗(yàn)形成的空白微乳均為澄清或略泛藍(lán)色，并均能在室溫下穩(wěn)定存在。

處方篩選優(yōu)化是自微乳制劑研究最關(guān)鍵的部分，目前可應(yīng)用正交試驗(yàn)、均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法等進(jìn)行研究，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)。其中，基于Design Expert 8.0.6 軟件試驗(yàn)設(shè)計(jì)、模型構(gòu)建、結(jié)果預(yù)測的單純形網(wǎng)格法是采用空間圖形淘汰法進(jìn)行處方優(yōu)選，通過因素之間的相互約束來影響指標(biāo)，在確定處方組成的響應(yīng)面和最佳范圍方面優(yōu)勢獨(dú)到，尤其適合自微乳這類組分總量恒定的劑型，而且考察因素?cái)?shù)目相同時(shí)實(shí)驗(yàn)次數(shù)少于星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，不必連續(xù)進(jìn)行多次試驗(yàn)，預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確。綜上所述，單純形網(wǎng)格法拓寬了自微乳處方篩選方法，可為相關(guān)優(yōu)化研究提供新思路。