龍柳艷,韋曉謀

(廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院暨柳州市工人醫(yī)院，廣西 柳州545005)

多瘤病毒是正常細(xì)胞異常增殖、分化的一類DNA病毒，因其能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生腫瘤而得名，其中包括猴多瘤病毒40(SV40)、人多瘤病毒JC病毒(JCV)及BK病毒(BKV)等，多瘤病毒呈全球性分布，在人群中廣泛傳播[1]。2007年，我院研究室調(diào)查研究顯示BKV在廣西瑤、侗、苗、壯等少數(shù)民族中存在較高感染率[2]。多瘤病毒感染通常表現(xiàn)為亞臨床癥狀，感染后呈潛伏狀態(tài)終生存在于體內(nèi)，當(dāng)感染者免疫功能(主要是T細(xì)胞功能)低下或抑制(如妊娠、HIV感染、器管移植等)時(shí)可被再度激活，在腫瘤、器官移植受者、HIV感染等免疫缺陷患者可引起嚴(yán)重疾病[3]。近年我國HIV感染率與AIDS發(fā)病率明顯上升，廣西艾滋病感染者和艾滋病病人的累計(jì)數(shù)在全國排第二位，柳州市又是我區(qū)艾滋病流行嚴(yán)重地區(qū)。因此，多瘤病毒SV40、BKV及JCV感染與HIV感染者相關(guān)性成為我們研究的內(nèi)容。

1 資料與方法

1．1 標(biāo)本來源于2008-2014年期間，柳州市公安局強(qiáng)制戒毒所，采用確認(rèn)試驗(yàn)免疫印跡法(WB)進(jìn)行HIV篩查，選取HIV感染者為研究組；隨機(jī)選取到我院參加健康體檢的健康成人為對照組；各500例，男女各半，年齡不限，收集上述研究對象靜脈血3 ml存于EDTA抗凝管，同時(shí)無菌管取新鮮中段尿50 ml。

1．2 儀器及試劑DNA核酸分析儀、DNA電泳儀、Pe5700-PCR儀、日立低溫高速離心機(jī)、日立低濕超速離心機(jī)旋渦混旋器及凝膠成像系統(tǒng)等分子生物學(xué)儀器，BKV-DNA、SV40-DNA、及JCV-DNA定性試劑。

1.3 操作方法(觀察指標(biāo)、具體操作過程及方法等)

1.3.1具體操作過程 于2008-2012年期間到柳州市公安局強(qiáng)制戒毒所，選取HIV感染者，為研究組；隨機(jī)選取到我院參加健康體檢的健康人員為對照組。各500例，男女各半，年齡不限。收集受試者空腹肝素抗凝靜脈血3 ml，尿液10 ml。分離PBLs，將細(xì)胞濃度調(diào)整為105/ml濃度，200 μl/管分裝，提取基因組DNA。

PCR反應(yīng)檢測SV40基因：上游引物5′-GCGTGACAGCCGGCGCAGCACCA-3′,下游引物5′-GTCCATTAGCTGCAAAGATTCCTC-3′(由上海申能博彩合成)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s ，30個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min，擴(kuò)增目的片段為487 bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，陽性質(zhì)控標(biāo)本購自解放軍總醫(yī)院，50 bp DNA Ladder購自申能博彩，結(jié)果如下圖1。

M：MARKER；2：陽性對照；3：陰性對照；4-8：HIV感染者；9-12：健康成人

PCR反應(yīng)檢測BKV基因：PCR擴(kuò)增BKV-DNA序列，2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR結(jié)果，第一次PCR擴(kuò)增：得到176 bpDNA產(chǎn)物，第二次PCR擴(kuò)增：得到149 bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致；結(jié)果如下圖2。

1-4：健康成人；5-9：HIV感染者；10：陰性對照；11：陽性對照；M：MARKER

PCR反應(yīng)檢測JCV基因：上游引物 5′-CCCCATACCAACTTAGCTTTC-3′,下游引物5′-CCAATTTGTAAGGCAGATAG-3′(由上海申能博彩合成)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min ，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s ，30個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min，擴(kuò)增目的片段為251 bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果如下圖3。

1.3.2觀察指標(biāo)及方法

觀察指標(biāo)：在瓊脂糖凝膠電泳中，在相應(yīng)區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)特異性片段為陽性，無特異性片段為陰性。

觀察方法：全部PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測是否有特異性片段產(chǎn)物產(chǎn)生。

1.3.3結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用PCR擴(kuò)增樣本中的多瘤病毒DNA，在瓊脂糖凝膠電泳中，在相應(yīng)區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)特異性片段為陽性，無特異性片段為陰性(參見《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版)。通過檢測HIV感染者及健康成人對照組血、尿標(biāo)本中多瘤病毒SV40、BKV及JCV的DNA，檢測其陽性率;并統(tǒng)計(jì)分析HIV感染者及健康成人對照組血、尿標(biāo)本多瘤病毒SV40、BKV及JCV的檢出率及其差別有無顯著性區(qū)別。

M：MARKER；2：陽性對照；3 ：陰性對照；4-8：HIV感染者；9-12：健康成人

1.3.4統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用PENS 3.1軟件系統(tǒng)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

采用PCR擴(kuò)增HIV感染者研究組及健康人員對照組血、尿標(biāo)標(biāo)本中的多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA及JCV-DNA，結(jié)果顯示：

2.1 HIV感染研究組與健康對照組比較HIV感染組外周血及尿液中多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA的陽性率均較健康成人對照組升高，差異有顯著性意義(P<0.05)，研究結(jié)果見表1。

2.2 不同性別組比較HIV感染者與健康成人中男、女不同性別組多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA檢測陽性率，差異無顯著性意義(P>0.05)，研究結(jié)果見表2。

2.3 不同年齡組比較HIV感染者與健康成人中18-35歲組、36-55歲組、56-85歲組，三個(gè)不同年齡組中多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA檢測陽性率，差異無顯著性意義(P>0.05)，研究結(jié)果見表3。

表1 HIV感染者中多瘤病毒的感染率

表2 不同性別多瘤病毒的感染率

表3 不同年齡多瘤病毒的感染率(P>0.05)

3 討論

截至2017年10月底，全國累計(jì)報(bào)告現(xiàn)住址為廣西的存活艾滋病感染者和病人80480例，累計(jì)報(bào)告死亡43582例。性傳播仍是我區(qū)艾滋病傳播的最主要途徑。2017年1-10月，廣西新發(fā)現(xiàn)報(bào)告的艾滋病病例中97%為性途徑傳播，其中異性傳播占91.5%，男男同性傳播占6.27%；50歲以上中老年病例占52.1%；初中以下文化程度的病例占84.5%。截至2018年底，我國估計(jì)存活艾滋病感染者約125萬，其中絕大多數(shù)為20-49歲中青年，但60歲以上年齡組所占比例在上升，廣西目前發(fā)現(xiàn)的感染艾滋病年齡最大的年逾90歲。目前對AIDS尚無根治方法，AIDS 患者通常并非因?yàn)镠IV感染直接致死，而是因?yàn)椴l(fā)惡性腫瘤和機(jī)會(huì)性感染或其他疾病而致死。

多瘤病毒是正常細(xì)胞異常增殖、分化的一類DNA病毒，因其能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生腫瘤而得名，2007年，我院研究室調(diào)查研究顯示BKV在廣西瑤、侗、苗、壯等少數(shù)民族中存在較高感染率。當(dāng)人體免疫功能低下，HIV感染者或移植等患者中，多瘤病毒可再度激活，引起相關(guān)疾病。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，對多瘤病毒感染的研究不斷深入，其與人類多種疾病的關(guān)系也逐漸明朗。如HIV患者合并JCV相關(guān)的進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病(PML)[4]；腎移植后病人并發(fā)BKV相關(guān)性腎病(BKVN)[5]等等，目前研究認(rèn)為多瘤病毒感染和人類多種疾病相關(guān)：出血性膀胱炎、間質(zhì)性腎小球腎炎、輸尿管狹窄、血管病變、肺炎、腦炎、視網(wǎng)膜炎甚至多器官功能衰竭[6]。因此，多瘤病毒SV40、BKV及JCV與HIV相關(guān)性也成為我們研究的內(nèi)容。

我們課題研究組于2008年至2014年期間，在柳州市公安局強(qiáng)制戒毒所選擇抗HIV抗體陽性者為HIV感染組，在我院體檢中心隨機(jī)選擇健康受檢人員為健康對照組，分別采集以上兩組研究對象EDTA抗凝靜脈血3 ml及新鮮尿樣標(biāo)本50 ml各500例，在我院檢驗(yàn)科PCR實(shí)驗(yàn)室由專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行PCR檢測比較。結(jié)果顯示：①多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA的陽性率，在HIV感染研究組血標(biāo)本中分別為：20.40%(102/500)、84.20%(421/500)、49.20%(246/500)；在HIV感染研究組尿標(biāo)本中分別為：14.60%(73/500)、68.40%(342/500)、40.6%(203/500)；在健康成人對照組血標(biāo)本中分別為：15.20%(76/500)、58.40%(292/500)、30.40%(152/500)；在健康成人對照組尿標(biāo)本中分別為：9.6%(48/500)、25.20%(126/500)、14.80%(74/500)。②與健康成人對照組相比，HIV感染者外周血及尿液中多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA的陽性率均升高，差異有顯著性意義(P<0.05)。③HIV感染者與健康成人中不同性別組、不同年齡組中多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA檢測陽性率，差異無顯著性意義。提示多瘤病毒SV40、BKV及JCV在健康人群中存在較高的感染率，多瘤病毒SV40、BKV及JCV的復(fù)活與HIV密切相關(guān)。

正常人群原發(fā)性多瘤病毒感染常發(fā)生于幼年時(shí)，常常無明顯的臨床癥狀，病毒不能完全被機(jī)體的免疫系統(tǒng)排除，而潛伏在腎組織和PBLs中[7]。但多瘤病毒抗體對多瘤病毒再次激活并無明顯抵抗作用，當(dāng)HIV感染者和病人免疫功能下降時(shí)，尤其是T細(xì)胞功能低下的患者中感染的多瘤病毒可反復(fù)激活，其子代病毒開始大量復(fù)制，導(dǎo)致腎功能減退乃至腎功能喪失、進(jìn)行性腦白質(zhì)病等各種嚴(yán)重病發(fā)癥。其中PML的死亡率是其他AIDS相關(guān)疾病的10倍[8]，是一種嚴(yán)重的致死性疾病。多瘤病毒感染威脅著AIDS病人的生活質(zhì)量和長期存活，是艾滋病患者的重要死因和并發(fā)癥之一，應(yīng)引起臨床足夠的重視。另外，對需要多次或長期輸血的艾滋病病毒感染者和艾滋病病人應(yīng)考慮首選去白細(xì)胞血液。因?yàn)?，以往未感染或獲得多瘤病毒SV40、BKV及JCV感染的艾滋病免疫缺陷患者，可以通過輸入多瘤病毒陽性白細(xì)胞血液而引起感染或再感染，所以對艾滋病病毒感染者和病人應(yīng)考慮輸入多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA及JCV-DNA陰性的血液或去白細(xì)胞血液，以避免艾滋病病毒感染者和艾滋病病人因多瘤病毒SV40、BKV及JCV感染或再感染或復(fù)活，而引發(fā)的相關(guān)性疾病，以更好的降低艾滋病的死亡發(fā)生率。輸血作為傳播多瘤病毒SV40、BKV及JCV的重要途徑之一，應(yīng)引起醫(yī)務(wù)工作者注意。

總之，目前，國內(nèi)對多瘤病毒感染及其相關(guān)性疾病還未引起重視，更缺乏臨床研究，并局限于少數(shù)研究室，國內(nèi)多瘤病毒研究水平與國際相比差距很大。臨床醫(yī)生和實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員對多瘤病毒感染的有關(guān)知識(shí)如臨床表現(xiàn)、診斷標(biāo)準(zhǔn)、防治措施、檢測技術(shù)等相當(dāng)缺乏，對多瘤病毒醫(yī)院感染的臨床意義沒有給以足夠的重視。2010年世界艾滋病日的主題是：實(shí)現(xiàn)“三零”的戰(zhàn)略目標(biāo)， 即零艾滋病新發(fā)感染、零艾滋病死亡、零歧視。艾滋病因免疫功能低下，機(jī)會(huì)性感染多，我們通過對HIV感染者及健康成人中多瘤病毒SV40、BKV及JCV感染陽性率的研究，提示多瘤病毒SV40、BKV及JCV的復(fù)活與HIV密切相關(guān)。進(jìn)一步加強(qiáng)多瘤病毒SV40、BKV及JCV感染在HIV感染者中臨床應(yīng)用的研究是本課題下一步的研究方向。為減少HIV感染者中因感染的多瘤病毒被激活而導(dǎo)致的相關(guān)疾??；為延長患者生存期，改善和提高AIDS的臨床治療和研究；為降低艾滋病的死亡發(fā)生率，為實(shí)現(xiàn)2010年聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署提出的“三零”戰(zhàn)略目標(biāo)提供理論依據(jù)；為進(jìn)一步提高HIV感染者的生活質(zhì)量、降低醫(yī)療費(fèi)用，減少家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)，具有不可估量的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。