孫 娜，王騰騰，韓慧宗，張明亮，王 斐，姜海濱

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室，煙臺 264006）

芽孢桿菌（Bacillus）是一類好氣或兼性厭氧的革蘭氏陽性桿狀細菌，具有穩(wěn)定性好、抗性強、復活率高等優(yōu)點［1］，能夠產生蛋白酶、淀粉酶等大分子物質以提高宿主的消化機能，促進營養(yǎng)物質的消化與吸收［2］。許多研究表明，芽孢桿菌可顯著改善養(yǎng)殖魚類的生長特性，預防及治療魚類的疾病。姚清華等［3］將枯草芽孢桿菌（B.subtilis）添加到飼料中投喂鰻鱺（Anguilla japonica），顯著提高了其腸道內蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活力；黃靈等［4］以含芽孢桿菌的飼料投喂珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂），達到了降低飼料系數(shù)、促進生長、提升免疫力的效果；CHAVES-POZO等［5］用添加了枯草芽孢桿菌的飼料投喂大黃魚（Larimichthys crocea），提高了大黃魚的增重率，調節(jié)了魚體非特異性免疫，減少了疾病的發(fā)生。因此，芽孢桿菌在海水魚養(yǎng)殖中的應用可促進其產業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展［2］。

隨著20世紀80年代海水魚生殖調控和苗種繁育技術的突破，海水魚類養(yǎng)殖產業(yè)得到突飛猛進的發(fā)展。但病害頻發(fā)等問題也隨之日益突出，嚴重制約了該產業(yè)的健康發(fā)展。從海水魚腸道內分離芽孢桿菌等益生菌，對于研制有效的微生態(tài)制劑以提高海水魚的抗病能力等具有重要意義。目前，解淀粉芽孢桿菌 （B.amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）以及短小芽孢桿菌（B.pumilus）等［3，6-8］均已被應用于海水魚養(yǎng)殖實驗中，并取得良好效果。但芽孢桿菌在海水魚養(yǎng)殖中的應用仍處于初步發(fā)展階段，可應用的種類相對較少，并且不同芽孢桿菌對不同魚類具有特異性，是否可以成為有利于魚體生長和免疫的益生菌尚缺乏相關的理論基礎，菌株特性及其對魚類生長發(fā)育的安全性等尚缺乏科學實驗依據(jù)。因此，本研究從海捕野生藍點馬鮫（Scomberomorus niphonius）和許氏平鲉（Sebastes schlegelii）腸道內分離、純化得到兩株芽孢桿菌，采用16S rDNA基因序列分析法對其進行分類鑒定，并對其生長特性、產酶特性及動物安全性進行了研究，旨在篩選能夠提高特定養(yǎng)殖魚類腸道酶活性并促進其生長的芽孢桿菌，進而為研發(fā)和推廣適用于海水魚養(yǎng)殖的微生態(tài)制劑提供候選菌株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

海捕野生藍點馬鮫（體長32.53 cm，體質量323.74 g）和許氏平鲉（體長26.82 cm，體質量467.06 g）購于山東煙臺，用于芽孢桿菌的分離。健康許氏平鲉［體長（12.77±0.86）cm，體質量（44.96±9.11）g］和大菱鲆［體長（13.82±1.88）cm，體質量（45.26±14.03）g］由煙臺泰華海洋科技有限公司提供，用于芽孢桿菌的安全性檢測實驗。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB固體及液體培養(yǎng)基購于生工生物工程（上海）股份有限公司，酪素培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、產脂肪酶定性培養(yǎng)基參照陶榮霞［9］的方法配置。

1.2 細菌分離純化

使用70%的酒精擦拭魚體腹部表面，無菌解剖，剪取前腸段，去除腸道內容物，無菌生理鹽水沖洗2次，刮取腸道內壁黏膜，加入無菌生理鹽水并渦旋振蕩搖勻，80℃水浴熱處理20 min，取100μL混合液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，根據(jù)菌落形態(tài)學特征對細菌進行分離、純化，并在-80℃條件下甘油保種。

1.3 細菌鑒定

1.3.1 形態(tài)觀察及生理生化特性鑒定

將保種的菌株接種于LB固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后觀察菌株形態(tài)、菌落顏色及菌落大??；并進行革蘭氏染色，采用梅里埃API 50 CHB試劑盒進行生理生化特性檢測，參照布坎南等［10］和東秀珠等［11］的方法對菌株進行初步鑒定。

1.3.2 16SrDNA基因序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用16S rDNA基因序列分析法對初步鑒定的細菌進行分子鑒定。通用引物為 8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、 1492R （5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′），擴增產物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至英濰捷基（上海）貿易有限公司北京測序實驗室進行測序。測序結果用BLAST軟件與GenBank中的有關序列進行同源性分析，利用Mega 6.0軟件構建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 生長特性分析

1.4.1 溫度對生長的影響

取100μL培養(yǎng)至指數(shù)期的菌懸液接種于LB液體培養(yǎng)基，分別置于 5、10、15、20、25、30、35、45、55℃下培養(yǎng)24 h，檢測600 nm的光密度，生長情況結果以△OD600值（終止時OD600-初始時OD600）表示，每個試驗組設置3個平行。

1.4.2 pH對生長的影響

取100μL培養(yǎng)至指數(shù)期的菌懸液接種于pH值分別為2、5、7、9和11的LB液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h后檢測600 nm的光密度，每個試驗組設置3個平行。

1.4.3 NaCl含量對生長的影響

取100μL培養(yǎng)至指數(shù)期的菌懸液接種于NaCl含量（w／v%）分別為 0、1%、2%、3%、4%、5%、6%和7%的LB液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h后檢測600 nm的光密度，每個試驗組設置3個平行。

1.5 產酶特性分析

無菌挑取芽孢桿菌分別點種到酪素培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基和產脂肪酶定性培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍是否產生明顯的水解圈。其中酪素培養(yǎng)基和產脂肪酶定性培養(yǎng)基可分別觀察到透明圈和顯色圈大小；淀粉培養(yǎng)基采用碘試劑染色法著色后觀察透明圈大小；并測量菌落和顯色圈的直徑［9］。

1.6 安全性檢測

安全性檢測實驗設計參照王騰騰等［12］和EL-RHMAN等［13］的方法。選取健康的許氏平鲉和大菱鲆各54尾，分別對篩選出的2株芽孢桿菌進行安全性檢測。每種菌株的檢測實驗共分3組，每組3個平行，每個平行分別包含實驗用魚各6尾，于70 L玻璃缸暫養(yǎng)7 d后用于實驗。暫養(yǎng)期間水溫（19±1）℃，日換水2次，連續(xù)充氣，不投喂食物，及時清理糞便。

芽孢桿菌在35℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12 h至指數(shù)期后，6 000 r·min-1離心5 min，用0.65%的無菌生理鹽水重懸至濃度為1×108cfu·mL-1。

第1、2組魚體分別用于2株芽孢桿菌的安全性檢測，每尾實驗用魚腹腔注射1 000μL 1×108cfu·mL-1菌懸液；第3組（對照組）每尾腹腔注射1 000μL 0.65%生理鹽水。注射后連續(xù)觀察14 d，分別記錄許氏平鲉和大菱鲆的活動、攝食、排便和存活等情況，實驗結束后解剖魚體，觀察魚體臟器有無發(fā)生病變。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS軟件包單因素方差分析法（oneway ANOVA）中的Duncan多重比較檢驗法進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)差異水平設置為P＜0.05；采用Origin 8.0軟件作圖，實驗數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差（x±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 細菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)學及生理生化鑒定

從藍點馬鮫和許氏平鲉腸道中共分離純化出37株細菌，通過細菌形態(tài)特征觀察、革蘭氏陰陽性鑒定及生理生化特征檢測初步篩選出2株芽孢桿菌，分別命名為YB1和YH2。YB1菌落凸起，呈白色，表面較粗糙無光澤，邊緣有褶皺；YH2菌落凸起，呈米黃色，表面有光澤，邊緣光滑無褶皺。革蘭氏染色均呈陽性，顯微鏡下觀察兩株菌均呈桿狀。YB1和YH2的生理生化特征鑒定結果如表1所示。

表1 YB1和YH2的生理生化特性鑒定結果Tab．1 Physiological and biochemical characterization of YB1 and YH2

2.1.2 分子生物學鑒定

PCR儀擴增細菌YB1和YH2的16S rDNA基因，獲得大小分別為1 431 bp和1 459 bp的片段，在NCBI數(shù)據(jù)庫中對YB1和YH2的序列信息進行相似性比對分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。結果表明：YB1和YH2均屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae）的芽孢桿菌屬，YB1與蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）YJK（HQ143569.1）的相似度為99%，YH2與壁芽孢桿菌（B.muralis）HlS3200905（MG011540.1）的相似度為98%。結合形態(tài)學及生理生化特征，確定菌株YB1為蠟樣芽孢桿菌，菌株YH2為壁芽孢桿菌。

2.2 YB1和YH2的生長特性

2.2.1 不同溫度下YB1和YH2的生長情況

菌株YB1在15～35℃條件下均能生長，且各溫度下YB1的生長情況存在顯著性差異（P＜0.05），在35℃時生長狀況最佳；隨著培養(yǎng)溫度升高，YB1培養(yǎng)液的△OD600值逐漸增大；當培養(yǎng)溫度過低（5℃、10℃）或溫度過高（45℃、55℃）時，YB1培養(yǎng)液的△OD600值最低，YB1基本不生長（圖2-a）。YH2在15～45℃條件下均能生長，且各溫度下YH2的生長情況存在顯著性差異（P＜0.05），在30℃時生長狀況最佳。在15～30℃，隨著培養(yǎng)溫度升高，YH2培養(yǎng)液的△OD600值逐漸增大；當培養(yǎng)溫度大于30℃時，YH2培養(yǎng)液的△OD600值逐漸降低；當培養(yǎng)溫度過低（5℃、10℃）或溫度過高（55℃）時，YH2培養(yǎng)液的△OD600值最低，YH2基本不生長（圖2-b）。

2.2.2 不同pH下YB1和YH2的生長情況

圖1 基于16S r DNA序列的菌株YB1和YH2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．1 Clustering results of strains YB1 and YH2 based on 16S r DNA gene sequence

菌株YB1在pH為5～9的培養(yǎng)基下均能生長，但生長情況存在顯著性差異（P＜0.05）：在pH為5～7的培養(yǎng)基中，隨著pH的升高，YB1培養(yǎng)液的△OD600值逐漸增加，在pH為7時達到最大，說明在該pH下YB1的生長情況最好；在7～9之間，培養(yǎng)液的△OD600值有所下降，當培養(yǎng)基pH過低（pH＝2）或過高（pH＝11），YB1基本不生長（圖3-a）。YH2在pH為5～9的培養(yǎng)基下均能生長，但其生長情況存在顯著性差異（P＜0.05）：在pH為5時生長狀況最佳；隨著pH的升高，YH2培養(yǎng)液的△OD600值逐漸降低，說明YH2適宜在偏酸環(huán)境下生長。當培養(yǎng)基pH過低（pH＝2）或過高（pH＝11），YH2基本不生長（圖3-b）。

圖2 不同溫度下YB1和YH2的生長情況Fig．2 Growth of YB1 and YH2 in various temperatures

圖3 不同pH下YB1和YH2的生長情況Fig．3 Growth of YB1 and YH2 in various pH

2.2.3 不同NaCl含量下YB1和YH2的生長情況

菌株YB1在NaCl含量為0～5%的LB培養(yǎng)基中均能生長；隨著NaCl含量的升高，YB1培養(yǎng)液的△OD600值逐漸降低，說明向LB培養(yǎng)基中添加NaCl不利于YB1的生長；當NaCl含量大于6%時，YB1基本不生長（圖4-a）。YH2在NaCl含量為0～7%的LB培養(yǎng)基中均能生長，在NaCl含量為2%時生長情況最佳；在0～2%的培養(yǎng)基中，隨著NaCl含量的升高，YH2培養(yǎng)液的△OD600值逐漸升高；在3%～7%時，隨著NaCl含量的升高，培養(yǎng)液的△OD600值逐漸下降（圖4-b）。

2.3 YB1和YH2的產酶特性

菌株YB1和YH2的產酶能力測試結果如圖5所示。YB1和YH2均具有產蛋白酶和淀粉酶的能力，不具有產脂肪酶的能力。測量分析YB1和YH2在培養(yǎng)基上產生透明圈與菌圈直徑比的大?。ū?），結果表明，YB1的產酶能力均強于YH2。

2.4 YB1和 YH2的安全性

以1×108cfu·mL-1濃度向許氏平鲉和大菱鲆腹腔注射YB1和YH2，觀察并統(tǒng)計實驗用魚的生存和死亡情況（表3）。結果顯示：注射YB1菌懸液的許氏平鲉和分別注射YB1和YH2菌懸液的大菱鲆游泳和攝食能力良好，未出現(xiàn)傷亡個體，解剖后內臟組織正常，無病變現(xiàn)象。而注射YH2菌懸液的許氏平鲉在第3天開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，實驗結束時共計6尾個體死亡，解剖存活和死亡魚體，內臟組織正常，無病變現(xiàn)象。以上結果表明：在注射濃度≤1×108cfu·mL-1時，YB1對大菱鲆和許氏平鲉均是相對安全的，而YH2僅對大菱鲆是相對安全的。

表2 芽孢桿菌YB1和YH2產蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶定性檢測透明圈-菌圈直徑比Tab．2 Ratios of transparent circle diameter to colony diameter in qualitative plate tests of protease，amylase and lipase

表3 YB1和YH2的安全性檢測實驗結果Tab．3 Safety test results of strains YB1 and YH2

圖4 不同NaCl含量下YB1和YH2的生長情況Fig．4 Growth of YB1 and YH2 with various NaCl concentrations

圖5 YB1和YH2產蛋白酶和淀粉酶定性檢測結果Fig．5 Results of protease and amylase qualitative tests of YB1 and YH2

3 討論

芽孢桿菌是一類產芽孢、抗應激、具有高活性消化酶系的異養(yǎng)細菌［14］，在海水魚腸道內定植后，能夠提高腸道消化酶的活力、抑制有害菌群的生長繁殖、調節(jié)腸道內環(huán)境的平衡，從而促進海水魚的生長，預防疾病的發(fā)生。目前，已有部分分離自海水魚腸道的芽孢桿菌得到了鑒定，如短小芽孢桿菌（B.pumilus）SE5和克勞氏芽孢桿菌（B.clausii）DE5分離自斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）［8］、枯草芽孢桿菌 M001分離自牙鲆（Paralichthys olivaceus）［15］，通過對其開展養(yǎng)殖評價實驗已取得了良好的益生效果。本研究首次從海捕野生藍點馬鮫和許氏平鲉腸道內分離獲得了兩株特征明顯的芽孢桿菌菌株YB1和YH2，分別鑒定為蠟樣芽孢桿菌YB1和壁芽孢桿菌 YH2。YB1在 15～35℃、pH 5～9、NaCl含量0～5%范圍內生長較快，YH2在15～45℃、pH 5～9、NaCl含量0～7%范圍內生長較快，表明2株芽孢桿菌對溫度、pH和NaCl含量具有廣泛的適應性，可適于不同海水魚類腸道環(huán)境。

魚類腸道中的芽孢桿菌可以通過分泌蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等多種胞外酶參與宿主的消化和免疫過程［16-18］。劉曉勇等［19］的研究表明，飼料中添加適量枯草芽孢桿菌可有效提高雜交鱘（Acipenser baeri♂×A.schrenkii♀）幼魚腸道內蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性，促進其生長；馬如龍等［20］的研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加芽孢桿菌可以提高石斑魚肝胰臟和腸道的消化酶活性；LIU等［21］的研究表明，飼料中添加枯草芽孢桿菌可顯著提高斜帶石斑魚頭腎白細胞的吞噬活性、呼吸爆發(fā)活性、SOD活性、血清LSZ活性和血清選擇性補體（ACH50）活性。本研究篩選的2株芽孢桿菌均具有較好的產蛋白酶和淀粉酶的能力，說明2株芽孢桿菌可以高效分解食物中的淀粉和蛋白質，定植于海水魚腸道內可以提高其腸道中淀粉酶和蛋白酶活力，促進海水魚對營養(yǎng)物質的消化吸收，從而促進海水魚的生長。

益生菌是一種活性微生物或微生物制劑，因其安全、無毒、無副作用等優(yōu)點在水產養(yǎng)殖中得到了良好的應用，但WANG等［22］提出馬來西亞發(fā)現(xiàn)的對蝦細菌性白斑病是由枯草芽孢桿菌引起的；胡宗云等［23］認為蠟樣芽孢桿菌是黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）“紅頭病”的病原菌之一。因此開發(fā)益生菌應用于生產前，為確保其對機體無致病性，必須開展安全性檢測。呂利群等［24］在開發(fā)解淀粉芽孢桿菌Sh1時發(fā)現(xiàn)，腹腔注射1×108cfu·mL-1的 Shl對草魚（Ctenopharyngodon idellus）的生長沒有任何不良影響；王騰騰等［12］在許氏平鲉養(yǎng)殖生產中應用食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）YH1前，驗證了YH1對魚體是安全的；巴翠玉等［25］在開發(fā)水產類微生態(tài)制劑時，通過腹腔注射證實了枯草芽孢桿菌對鯽（Carassius auratus）無致病性。本研究中動物安全性檢測實驗表明，YB1在濃度≤1×108cfu·mL-1對大菱鲆和許氏平鲉均是相對安全的，YH2在濃度≤1×108cfu·mL-1對大菱鲆是相對安全的，注射YH2的許氏平鲉出現(xiàn)6尾死亡的情況，故排除其作為許氏平鲉益生菌的可能性，因此2株芽孢桿菌對特定養(yǎng)殖對象是安全的。本研究為下一步探究蠟樣芽孢桿菌YB1和壁芽孢桿菌YH2對特定養(yǎng)殖對象生長和免疫的影響提供了理論依據(jù)，為其應用于生產提供了可能。

綜上所述，本研究分析了蠟樣芽孢桿菌YB1和壁芽孢桿菌YH2的生長條件，驗證了其產酶特性和動物安全性，顯示了YB1和YH2作為有益菌用于海水魚養(yǎng)殖的潛力。