廖小婷 曾 彬 劉 磊

急性缺氧和復(fù)氧損傷是一種常見(jiàn)的環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)，可造成一系列病理生理過(guò)程，包括急性氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙和炎癥[1,2]。發(fā)生急性心肌梗死后，常并發(fā)嚴(yán)重的缺血再灌注損傷。越來(lái)越多的研究證明甲狀腺激素對(duì)胚胎心肌的發(fā)育至關(guān)重要，且成年后甲狀腺激素通過(guò)激活發(fā)育基因編程來(lái)調(diào)控心臟修復(fù)或再生[3,4]。本研究采用體外培養(yǎng)乳小鼠原代心肌細(xì)胞，進(jìn)行缺氧及缺氧/復(fù)氧損傷來(lái)模擬體內(nèi)缺血及缺血再灌注損傷，并對(duì)缺氧復(fù)氧細(xì)胞進(jìn)行T3預(yù)處理，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞技術(shù)、JC-1免疫熒光染色、Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，研究不同缺氧時(shí)間及缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞的損害程度，以及運(yùn)用甲狀腺素T3對(duì)心肌細(xì)胞的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:(1)動(dòng)物：1～2天齡的新生昆明乳鼠，雌雄不限，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。(2)試劑：DMEM-F12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone 公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibico 公司)，胰酶(美國(guó)Beyontime 公司)，膠原酶Ⅱ(美國(guó)Sigma 公司)，PBS液，青-鏈霉素抗生素(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(天津三箭生物技術(shù)有限公司)，JC-1試劑盒(北京索萊寶科技公司)，兔抗鼠抗磷酸化Akt多抗(美國(guó)CST公司)，兔抗鼠抗磷酸化PI3K多抗(英國(guó)Abcam公司)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(美國(guó)Aspen公司)。

2.心肌細(xì)胞培養(yǎng)：采用改良的兩步法分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞[5]。取1～2天的新生乳小鼠，取出心臟，置于預(yù)冷PBS緩沖液中清洗2～3遍，修剪心臟，減去多余的血管、心房及心外膜組織。在0.125%胰酶中將心臟稍稍剪開(kāi)但不剪碎，將心臟組織吸入15ml離心管中，加入0.125%胰酶10ml靜置，4℃過(guò)夜(10～12h)。第2天，吸出上清液，加入含0.035%膠原酶Ⅱ的消化液6ml，置于37℃水浴輕輕振搖3～5min，待液體變混濁后及停止消化，重復(fù)消化6～7次。將收集的上清液以1000r/min離心10min，棄上清，加入適量含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)液(1%青-鏈霉素抗生素)重懸細(xì)胞，接種于10cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁1h去除成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞懸液種于35mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為1×106，培養(yǎng)24h后，用倒置顯微鏡觀察。

3.心肌細(xì)胞缺氧及缺氧/復(fù)氧模型的建立：模擬心肌缺血損傷，細(xì)胞貼壁完全且搏動(dòng)良好后，吸去培養(yǎng)液，加入2ml不含血清的DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱(94%N2、5%CO2、1%O2,37℃)中培養(yǎng)。心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立：模擬心肌缺氧/復(fù)氧損傷，細(xì)胞貼壁完全且搏動(dòng)良好后，吸去培養(yǎng)液，加入2ml不含血清的DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱(94%N2、5%CO2、1%O2,37℃)中培養(yǎng)，后棄去培養(yǎng)液，加入含15%胎牛血清的培養(yǎng)液2ml，放入培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中復(fù)氧，即完成缺氧/復(fù)氧過(guò)程。T3預(yù)處理：心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧處理前，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入20μmol/L T3孵育24h，缺氧時(shí)，換用含20μmol/L T3的2ml不含血清的DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基，復(fù)氧時(shí)加入含20μmol/L T3的2ml完全培養(yǎng)液。

4.實(shí)驗(yàn)分組：分離的原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)48h后，心肌細(xì)細(xì)胞缺氧及缺氧/復(fù)氧模型建立分組：正常對(duì)照(control)組；缺氧2h(H2)組；缺氧4h(H4)組；缺氧6h(H6)組；缺氧8h(H8)組；缺氧4h/復(fù)氧2h(H4/R2)組。T3藥物效應(yīng)分組：正常對(duì)照(control)組；缺氧5h復(fù)氧2h(H/R)組；T3預(yù)處理+缺氧/復(fù)氧(T3+H/R)組。

5.心肌細(xì)胞狀態(tài)及搏動(dòng)頻率觀察:將完成缺氧、缺氧/復(fù)氧及正常培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行境下觀察，觀察細(xì)胞狀態(tài)，搏動(dòng)強(qiáng)度并計(jì)數(shù)細(xì)胞搏動(dòng)頻率。

6.流式細(xì)胞分析:細(xì)胞進(jìn)行不同處理后，用0.25%胰酶1ml洗滌2～3min，收集細(xì)胞懸浮液及培養(yǎng)液進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以Annexin V-FITC及PI雙染分析細(xì)胞凋亡情況。每組用胰酶消化細(xì)胞后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為106/L的細(xì)胞懸液，每組加入195μl的FITC結(jié)合液，再加入5μl FITC染液，室溫避光孵育15min，后每組加入5μl碘化丙啶(PI)染液，室溫避光孵育5min，在流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)上進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。左下象限：活細(xì)胞比例，Annexin V陰性-PI陰性的細(xì)胞；右下象限：凋亡早期細(xì)胞比例，Annexin V陽(yáng)性-PI陰性的細(xì)胞；右上象限：晚期凋亡細(xì)胞比例，Annexin V陽(yáng)性-PI陽(yáng)性的細(xì)胞；左上象限：操作過(guò)于劇烈而發(fā)生機(jī)械損傷的細(xì)胞，Annexin V陰性-PI陽(yáng)性的細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的比例即為凋亡早期細(xì)胞比例+凋亡晚期細(xì)胞比例。

7.線粒體膜電位檢測(cè)：對(duì)于control組、H/R組及T3+H/R組，細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，加入1ml JC-1染色工作液，37℃避光孵育20min，后棄上清，用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌3次，吸去多余的染色工作液，加入1ml含胎牛血清的完全培養(yǎng)液，于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。檢測(cè) JC-1 單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm，發(fā)射光設(shè)置為 530nm；檢測(cè) JC-1 聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為 525nm，發(fā)射光設(shè)置為 590nm。

8.Western blot法檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá)：取control組、H/R組及T3+H/R組細(xì)胞，加入裂解液進(jìn)行蛋白提純，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，然后用兔抗鼠cleaved caspase-3(稀釋度 1∶500，英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)4060)以及兔抗鼠Bax(稀釋度 1∶2000，美國(guó)CST公司，貨號(hào)ab18250)抗體4℃孵育過(guò)夜。次日用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋度1∶10000，美國(guó)Aspen公司，貨號(hào)AS1107)室溫孵育1h，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值反映Bax 和cleaved caspase-3的表達(dá)。

結(jié) 果

1.顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài):剛開(kāi)始接種的心肌細(xì)胞成球形，懸浮于培養(yǎng)液中，12h后觀察已有心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，24h后，大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁，呈三角形或不規(guī)則的星行，大部分細(xì)胞開(kāi)始搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率不一；48h后觀察心肌細(xì)胞全部貼壁，并伸出偽足，相互交接成網(wǎng)，并形成單層和放射狀排列的細(xì)胞簇，且心肌細(xì)胞搏動(dòng)同步化，搏動(dòng)頻率一致，約100次/分左右。心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)缺氧處理后細(xì)胞搏動(dòng)能力減弱，搏動(dòng)頻率降低，計(jì)數(shù)不同處理組細(xì)胞的搏動(dòng)頻率(表1)，與正常培養(yǎng)細(xì)胞比較，缺氧損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞搏動(dòng)能力減弱，搏動(dòng)頻率降低；缺氧時(shí)間越長(zhǎng)，心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率越低(P<0.05)。

2.缺氧及缺氧/復(fù)氧對(duì)心室肌細(xì)胞凋亡的影響:采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率，缺氧損傷后，心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸增加；且與單純?nèi)毖鯎p傷比較，缺氧/復(fù)氧損傷顯著增加細(xì)胞凋亡率(圖1)，各組心室肌細(xì)胞凋亡率見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞搏動(dòng)頻率、凋亡率比較

圖1 不同缺氧時(shí)間及缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

3.T3減少缺氧/復(fù)氧致心室肌細(xì)胞凋亡:確定缺氧/復(fù)氧模型對(duì)心肌細(xì)胞損傷更大后，采用缺氧/復(fù)氧損傷模型檢測(cè)T3對(duì)心肌細(xì)胞的影響，對(duì)正常對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組、T3+缺氧/復(fù)氧組進(jìn)行流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)與缺氧/復(fù)氧組比較，T3可明顯降低細(xì)胞凋亡率(P<0.05,n=3)。Western blot法檢測(cè)可見(jiàn)與正常培養(yǎng)細(xì)胞比較，缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞Bax、caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(圖2)，T3預(yù)處理可降低缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞Bax、caspase-3蛋白表達(dá)(P<0.05,n=3)。

圖2 T3對(duì)缺氧/復(fù)氧致心室肌細(xì)胞凋亡的影響A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；B.不同處理組心肌細(xì)胞凋亡率柱狀圖；C.Western blot法檢測(cè)凋亡蛋白Bax、caspase-3表達(dá)；D.不同組心肌細(xì)胞caspase-3/β-actin比例；E.不同組心肌細(xì)胞Bax/β-actin比例。與正常對(duì)照組比較，*P=0.000;與缺氧/復(fù)氧+T3組比較，#P<0.01,##P=0.000

4.T3減少心室肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧所致線粒體膜電位下降:采用缺氧/復(fù)氧損傷模型檢測(cè)T3對(duì)心肌細(xì)胞線的粒體膜電位影響，對(duì)正常對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組、T3+缺氧/復(fù)氧組進(jìn)行JC-1染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體紅綠比，如圖3所示，正常培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)JC-1染色，境下多為發(fā)紅光線粒體，而缺氧/復(fù)氧損傷后發(fā)紅光線粒體減少，發(fā)綠光線粒體增加，紅綠比降低，說(shuō)明缺氧/復(fù)氧損傷心室肌細(xì)胞線粒體，造成線粒體膜電位降低。經(jīng)過(guò)T3預(yù)處理的心肌細(xì)胞，境下可見(jiàn)發(fā)綠光的線粒體減少，線粒體紅綠比增加。

圖3 熒光顯微鏡下T3對(duì)缺氧/復(fù)氧致心室肌細(xì)胞線粒體膜電位影響(JC-1染色,×200)

討 論

隨著細(xì)胞與分子水平研究的不斷深入，心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)已經(jīng)成為心血管研究的重要方法和計(jì)數(shù)基礎(chǔ)，與大鼠心肌細(xì)胞比較，小鼠的心肌細(xì)胞較脆弱易損，在消化過(guò)程中會(huì)由于消化時(shí)間和力度造成細(xì)胞損傷，致心肌細(xì)胞貼壁不佳甚至幾乎不貼壁的現(xiàn)象[5]。因此小鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)對(duì)于消化要求更高，本實(shí)驗(yàn)采用改良的兩步法分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞，與傳統(tǒng)的胰酶消化或混合酶(胰酶+混合酶)消化比較，這種方法得到的心肌細(xì)胞成活率更高，純度更好[3,5,6]。

本實(shí)驗(yàn)采用三氣培養(yǎng)箱進(jìn)行心肌細(xì)胞缺氧環(huán)境，1%O2常用于心肌細(xì)胞體外缺氧模型，因此本實(shí)驗(yàn)也采用了1%O2誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧環(huán)境。表1可見(jiàn)，隨著缺氧時(shí)間的不斷增加，心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率逐漸降低。筆者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌細(xì)胞缺氧時(shí)間達(dá)到8h時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降低，大量細(xì)胞失去活性，流式凋亡檢測(cè)也證明了當(dāng)缺氧8h時(shí)細(xì)胞凋亡率高達(dá)60%左右，有研究顯示8h缺氧處理誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞變化足夠用作細(xì)胞相關(guān)研究[7]。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置細(xì)胞缺氧時(shí)間梯度最大值為8h。在進(jìn)行不同缺氧時(shí)間處理的基礎(chǔ)上，筆者對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了缺氧/復(fù)氧損傷，與缺氧4h比較，缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞造成的損傷更大，細(xì)胞凋亡率更高，說(shuō)明復(fù)氧進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。研究證明細(xì)胞凋亡是心肌再灌注損傷的特征之一，再灌注損傷可加速不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞凋亡[8～10]。且有研究顯示，細(xì)胞缺氧后復(fù)氧造成的進(jìn)一步損傷在1h后趨于平緩[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，缺氧6h時(shí)，細(xì)胞損傷率加大，因此筆者采用缺氧5h復(fù)氧2h來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

甲狀腺激素T3是人體重要的激素，可調(diào)節(jié)機(jī)體器官的生長(zhǎng)發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素可以增強(qiáng)左心室收縮功能，改善心室舒張功能及減少外周血管阻力[12,13]。且急性心肌梗死、心力衰竭等都伴隨著體內(nèi)甲狀腺激素水平的改變[14,15]。甲狀腺激素可調(diào)控心肌收縮及鈣處理蛋白表達(dá)，離子通道激活和交感神經(jīng)興奮，既往研究顯示急性心肌梗死后運(yùn)用低劑量甲狀腺素治療可以增強(qiáng)心室收縮，減少心肌細(xì)胞凋亡，從而改善梗死后心功能[15～17]。本實(shí)驗(yàn)中T3預(yù)處理可降低缺氧/復(fù)氧致心室肌細(xì)胞凋亡，并減少凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達(dá)，從而發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，其中線粒體損傷是心肌細(xì)胞凋亡和心臟收縮功能障礙的重要原因[18]。在缺血再灌注損傷過(guò)程中，過(guò)量的活性氧導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，然后使Bax蛋白向線粒體外膜易位，從而觸發(fā)線粒體凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18～20]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)JC-1染色檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體，發(fā)現(xiàn)缺氧/復(fù)氧損傷可降低線粒體膜電位，說(shuō)明缺氧/復(fù)氧損傷了心肌細(xì)線粒體，而T3可以恢復(fù)缺氧/復(fù)氧損傷造成的線粒體膜電位降低，保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體，減少心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞可以更好地進(jìn)行分子機(jī)制的研究，缺氧/復(fù)氧模型的建立可以模擬體內(nèi)心肌缺血再灌注損傷。缺氧/復(fù)氧可加重心肌細(xì)胞損傷，降低線粒體膜電位，甲狀腺素T3可以增加線粒體膜電位，減少細(xì)胞凋亡率，保護(hù)缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞損傷。