彭珂楠，周雪珂，殷鑫歡，李 飛，蔡 瑤，曾喻兵，江朝源，張儒博，楊澤曉，徐志文，3，朱 玲，3，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610044； 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

大腸埃希菌(Escherichiacoli)是一種能引起人畜共患病的革蘭氏陰性短桿菌，普遍存在于自然環(huán)境中，通過各種途徑對畜禽養(yǎng)殖業(yè)、食品、水域環(huán)境造成嚴(yán)重的污染和經(jīng)濟(jì)損失[1]。豬大腸桿菌病是由致病性大腸埃希菌引起的仔豬腸道傳染病，常見的有仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病3種，以發(fā)生腸炎、腸毒血癥為特征[2]。實(shí)際生產(chǎn)中，常使用抗生素來治療大腸桿菌病[3]，由于大腸埃希菌易產(chǎn)生耐藥性，尤其近年來抗菌藥物的廣泛使用，使耐藥菌株不斷增加[3-4]，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展。

細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilms，BF)是指由細(xì)菌自身分泌的多聚基質(zhì)包裹、能黏附于某種有生命或無生命固體表面的細(xì)菌聚集膜樣物[5]，能增加細(xì)菌定植能力、感染力，提高其對抗生素的耐受性和耐藥性。高致病性毒力島(high pathogenicity island，HPI)最初發(fā)現(xiàn)于耶爾森菌中，可在耶爾森菌、大腸埃希菌及沙門氏菌間水平傳播[6-8]，是決定細(xì)菌致病性和毒力的重要因素之一。HPI毒力島的主要結(jié)構(gòu)基因包括irp1、irp2和fyuA基因，irp2基因作為鐵調(diào)節(jié)基因，僅存在于強(qiáng)致病株中，與細(xì)菌毒力密切相關(guān)。由于irp2基因核苷酸序列具有高度保守性，成為用來判斷和檢測病原菌是否存在HPI毒力島的標(biāo)志基因[9-10]。

本試驗(yàn)自2016年至2018年間從四川地區(qū)不同養(yǎng)殖場的患病豬體內(nèi)分離到22株致病性大腸埃希菌，并對其進(jìn)行分子分群、耐藥性和BF形成能力研究，同時(shí)對耐藥基因類型及3種HPI毒力島基因攜帶情況進(jìn)行檢測分析，以期進(jìn)一步了解四川省豬源致病性大腸埃希菌的分子流行特點(diǎn)，為四川地區(qū)豬致病性大腸埃希菌的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2016—2018年，從四川地區(qū)不同養(yǎng)豬場出現(xiàn)消瘦、腹瀉、水腫甚至死亡的病豬中，無菌采集肝臟、脾臟、肺臟、腸道等組織樣品208份。

1.1.2 主要試劑及試驗(yàn)動物

LB肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、藥敏紙片購自四川瑞進(jìn)特科技有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA Maker、ddH2O購自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購于TIANGEN公司；8周齡的健康BALB/c小鼠購自達(dá)碩公司。

1.2 材料

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定

樣品接種麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，觀察菌落形態(tài)，挑取可疑單個(gè)菌落接種于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h，所有分離株經(jīng)革蘭染色后鏡檢、生化鑒定和16S rRNA分析鑒定。分離株保存在終濃度30%的甘油肉湯中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性試驗(yàn)

6只健康小鼠隨機(jī)分為2組，第1組注射大腸埃希菌菌液，第2組注射生理鹽水。挑取單菌落37 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜，4 ℃、5 000 r·min-1離心5 min收集菌體，用無菌生理鹽水懸浮菌體，試驗(yàn)組小鼠腹腔注射0.2 mL(6×108CFU·mL-1)菌液，對照組腹腔注射等量生理鹽水。觀察并記錄小鼠臨床表現(xiàn)及死亡情況，剖檢死亡小鼠，并分離細(xì)菌。

1.2.3 耐藥試驗(yàn)

將22株分離菌以LB肉湯稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，用紙片擴(kuò)散法檢測被檢菌株對左氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、新霉素、丁胺卡那、慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、頭孢曲松、氨芐西林、阿莫西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、紅霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、多粘菌素B、四環(huán)素、多西環(huán)素等19種抗菌藥的敏感性，按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.4 生物被膜的形成

參考文獻(xiàn)[11]，采用結(jié)晶紫微孔板法對分離菌株進(jìn)行生物被膜的定量檢測，每株菌株設(shè)4個(gè)平行孔，置于酶標(biāo)儀上檢測595 nm下的吸光度值，重復(fù)檢測3次，取平均值。以陰性對照孔吸光度值的2倍作為判斷能否形成生物被膜的臨界點(diǎn)Dc。當(dāng)D≤Dc時(shí)，表示細(xì)菌形成生物被膜能力為零；當(dāng)Dc2Dc時(shí)，表示細(xì)菌形成生物被膜的能力較強(qiáng)。

1.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分群分析

參考文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行分子分群，設(shè)計(jì)3對大腸埃希菌分群引物(表1)，采用多重PCR方法對分離菌株進(jìn)行分群鑒定，用1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

1.2.6 分離菌株耐藥基因及毒力基因檢測

根據(jù)文獻(xiàn)[1]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成耐藥基因TEM、SHV、OXA、sulⅠ、sulⅡ、acc(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅱ、cmlA、floR、tetA、tetB、qurB及HPI毒力島基因irp1、irp2、fyuA引物序列(表2)。以22株致病性大腸埃希菌分離株基因組DNA為模板對12種耐藥基因及3種HPI毒力島基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)基因分別取1株進(jìn)行膠回收并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫相應(yīng)序列進(jìn)行同源性對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸埃希菌分離鑒定結(jié)果

無菌采集患病豬組織病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果顯示，87株分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上為邊緣淺紅色中心深桃紅色，圓形扁平菌落，邊緣整齊，表面光滑濕潤；經(jīng)革蘭染色及鏡檢可見其形態(tài)為單個(gè)存在的陰性兩端鈍圓的桿狀菌；生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)菌株可以發(fā)酵乳糖和山梨醇，吲哚和甲基紅試驗(yàn)均為陽性，乙酰甲基甲醇試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陰性，氧化酶試驗(yàn)和硫化氫試驗(yàn)陰性，均符合大腸埃希菌的特點(diǎn)；16S rRNA檢測結(jié)果可獲得1 500 bp的目的條帶，經(jīng)過測序比對均確認(rèn)為大腸埃希菌。

表1 引物信息

Table1Primers information

檢測基因Gene引物序列Primersequences(5′-3′)基因登錄號GenBankaccessionNo.產(chǎn)物大小Productsize/bpChuAF:GACGAACCAACGGTCAGGAT;R:TGCCGCCAGTACCAAAGACAU67920.1279YjaAF:TGAAGTGTCAGGAGACGCTG;R:ATGGAGAATGCGTTCCTCAACMH511178.1211TspE4.C2F:GAGTAATGTCGGGGCATTCA;R:CGCGCCAACAAAGTATTACGMH511180.1152

表2 引物信息

Table2Primers information

基因類型Genotype基因Gene引物序列Primersequences(5′-3′)基因登錄號GenBankaccessionNo.產(chǎn)物大小Productsize/bpβ-內(nèi)酰胺類TEMF:ACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCC;R:ACCCACTCGTGCACCCAACTGFJ668751118β-LactamSHVF:GCGACAACGTCACCCGCCTT;R:TTGCGAACGGGCGCTCAGACFJ668798132OXAF:ACAGAAGCATGGCTCGAAAGT;R:TTGCTGTGAATCCTGCACCAGQ896560190磺胺類sulⅠF:TCGGACAGGGCGTCTAAG;R:GGGTATCGGAGCGTTTGCAM295981925SulfonamidessulⅡF:TGCCATCCCTGGTCAGAGTGCAG;R:GCAGTCAATGGGCGCAAGCTGTFJ705354179氨基糖苷類Acc(3)-ⅡF:GGCGACTTCACCGTTTCT;R:GGACCGATCACCCTACGAGX13543412Amimoglycosidesaph(3′)-ⅡF:CGTATTTCGTCTCGCTCAG;R:GATTCCGACTCGTCCAACNC009656232氯霉素類cmlAF:GGGTGGCGGGCTATCTTT;R:GCGACACCAATACCCACTAGAJ487033467ChloramphenicolfloRF:GAACACGACGCCCGCTAT;R:TTCCGCTTGGCCTATGAGDQ206638601四環(huán)素類tetAF:TTGGCATTCTGCATTCACTCG;R:CCACCCGTTCCACGTTGTTX75761344TetracyclinestetBF:TTCACCGCATAGTCCCTT;R:TGCAATAAATCCGAGCAGV00611388喹諾酮類qurBF:CTATGATCGTGAAAGCCAGAAAGG;NC010943427QuinolonesR:CCGAATATCTAAGTCACCCAACTCCHPI毒力基因irp1F:CCGGTTATTGTGAAGGTT;R:GTGAATGTTACGGCACTAAY12527799HPIvirulenceirp2F:AAGGATTCGCTGTTACCGGAC;R:AACTCCTGATACAGGTGGCL18881414genesfyuAF:GCTTTATCCTCTGGCCTT;R:GGCATATTGACGATTAACGZ35486948

2.2 致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠在接種大腸埃希菌分離株24～48 h后，出現(xiàn)了精神沉郁、食欲減退等癥狀，逐漸出現(xiàn)死亡。剖檢死亡小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，從小鼠的肝臟中分離到大腸埃希菌，對照組小鼠未出現(xiàn)明顯的變化。通過致病性試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)與分析，共篩選出22株致病性大腸埃希菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

大腸埃希菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表可知，22株大腸埃希菌對阿莫西林、紅霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、氨芐西林、氟苯尼考、多西環(huán)素、鏈霉素有較強(qiáng)的耐藥性，耐藥率均在80%以上；對左氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢曲松4種藥物的耐藥率為63.64%～72.73%；對新霉素、頭孢噻肟、大觀霉素、丁胺卡那、頭孢吡肟、多粘菌素B的耐藥率低于60%，表現(xiàn)出不同程度的敏感性。

2.4 生物被膜形成能力

利用結(jié)晶紫染色定量法測定分離的大腸埃希菌生物被膜形成能力，結(jié)果顯示，22株大腸埃希菌分離株有16株可以形成生物被膜，占分離菌總數(shù)的72.73%，其中強(qiáng)成膜能力菌株9株，弱成膜能力菌株7株。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分群分析結(jié)果

據(jù)文獻(xiàn)[12]所建立的方法，對22株豬源致病性大腸埃希菌進(jìn)行分群鑒定。如圖1所示，A群大腸埃希菌比例為59.09%(13/22)，B1群大腸埃希菌比例為4.55%(1/22)，B2群大腸埃希菌比例為22.73%(5/22)，D群大腸埃希菌比例13.64%(3/22)。

2.6 耐藥基因及HPI毒力島基因檢測結(jié)果

22株豬源致病性大腸埃希菌TEM、SHV、OXA、sulⅠ、sulⅡ、acc(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅱ、cmlA、floR、tetA、tetB、qurB等12種耐藥基因及irp1、irp2、fyuA等3種HPI毒力島基因凝膠電泳成像結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，15種基因片段大小與目的條帶大小一致。從檢出的耐藥基因型中各取1份陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測序，測序結(jié)果與GenBank收錄的對應(yīng)基因序列同源性均在98%以上。耐藥基因及HPI毒力島基因攜帶情況見表4。

表3 大腸埃希菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Table3Drug sensitive results ofEscherichiacoliisolates

抗菌素Antibiotics耐藥Resistant菌株數(shù)No.所占比例Proportion/%中介Intermediary菌株數(shù)No.所占比例Proportion/%敏感Senstive菌株數(shù)No.所占比例Proportion/%喹諾酮類Quinolones左氧氟沙星Levofloxacin1672.7300627.27諾氟沙星Norfloxacin1672.7314.55522.73恩諾沙星Enrofloxacin1986.36313.6400氨基糖苷類Amimoglycosides新霉素Neomycin1254.55418.18627.27丁胺卡那Amikacin627.27313.641359.09慶大霉素Gentamicin1568.1800731.82鏈霉素Streptomycin1881.8229.0929.09大觀霉素Spectinomycin836.36313.641150β-內(nèi)酰胺類β-Lactam頭孢曲松Ceftriaxone1463.64313.64522.73氨芐西林Ampicillin1986.3600313.64阿莫西林Amoxicillin22100.000000頭孢吡肟Cefepime627.27418.181254.55頭孢噻肟Cefotaxime1254.55940.9114.55大環(huán)內(nèi)酯類Macrolide紅霉素Erythrocin22100.000000氯霉素類Chloramphenicol氟苯尼考Florfenicol1986.3614.5529.09磺胺類Sulfonamides復(fù)方新諾明Selectrin2090.9129.0900脂肽類Daptomycin多粘菌素BPolymyxinB14.55940.911254.55四環(huán)素類Tetracyclines四環(huán)素Tetracycline2195.4514.5500多西環(huán)素Doxycycline1986.36313.6400

M，DL 2 000 marker；1、8、11-22，A群；14，B1群；2-6，B2群；7、9、10，D群。M， DL 2 000 marker；1, 8, 11-22: A group; 14， B1 group; 2-6， B2 group; 7, 9, 10: D group.

M，DNA Maker DL 2000；1-15:基因1，OXA基因；2，sul Ⅰ基因；3，tetA基因；4，acc(3)-Ⅱ基因；5，aph(3’)-Ⅱ基因；6，cmlA基因；7，floR基因；8，irp2基因；9，qnrB基因；10，fyuA基因；11，irp1基因；12，tetB基因；13，sul Ⅱ基因；14，SHV基因；15，TEM基因。M， DNA Maker DL 2000; 1， OXA gene; 2， sul Ⅰ gene; 3， tetA gene; 4， acc(3)-Ⅱ gene; 5， aph(3’)-Ⅱ gene; 6， cmlA gene; 7， floR gene; 8， irp2 gene; 9， qnrB gene; 10， fyuA gene; 11， irp1 gene; 12， tetB gene; 13， sul Ⅱ gene; 14， SHV gene; 15， TEM gene.

表4 大腸埃希菌耐藥基因及HPI毒力島基因檢出結(jié)果

Table4Detection of resistant genes and HPI virulence genes inEscherichiacolifrom swine

抗菌素Antibiotics基因Gene陽性菌株數(shù)Numberofpositivestrains陽性檢出率Positiverate/%β-內(nèi)酰胺類β-LactamTEM836.36SHV29.09OXA29.09氨基糖苷類Amimoglycosidesacc(3)-Ⅱ1568.18aph(3’)-Ⅱ1150.00磺胺類SulfonamidessulⅠ1463.64sulⅡ2195.45氯霉素類ChloramphenicolcmlA1045.45floR1881.82四環(huán)素類TetracyclinestetA1881.82tetB1986.36喹諾酮類QuinolonesqnrB940.91HPI毒力島基因HPIvirulencegenesirp1940.91irp2313.64fyuA313.64

結(jié)果顯示，22株豬源致病性大腸埃希菌中，磺胺類耐藥基因sulⅡ，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB，氯霉素類耐藥基因floR攜帶率均高于80%；氨基糖苷類耐藥基因acc(3)-Ⅱ，磺胺類耐藥基因sulⅠ攜帶率也較高；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM、SHV、OXA，氨基糖苷類耐藥基因aph(3’)-Ⅱ，氯霉素類耐藥基因cmlA，喹諾酮類耐藥基因qnrB攜帶率相對較低。HPI毒力島基因irp1、irp2、fyuA攜帶率分別為40.91%、13.64%、13.64%。

3 討論

大腸埃希菌可分為A、B1、B2和D共4個(gè)群，B2和D群是主要的腸道外致病大腸埃希菌[13-14]。李金朋等[15]研究顯示，河南地區(qū)致病性大腸埃希菌分離菌多屬于B2、D致病群；胡林等[16]對華東部分地區(qū)禽致病性大腸埃希菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，分離菌主要分布于A、B1群。本研究對四川地區(qū)分離的22株致病性大腸埃希菌進(jìn)行分子分群及生物被膜形成能力分析，其中A群所占比例最大，B2群次之，與河南、華東地區(qū)的研究結(jié)果有所差異。大腸埃希菌生物被膜形成陽性率為72.73%，其中強(qiáng)成膜能力菌株占40.91%，總體陽性率所占比例較高，這一結(jié)果可能與分離株較強(qiáng)的耐藥性有關(guān)，但具體關(guān)聯(lián)還需進(jìn)一步分析。

22株致病性大腸埃希菌對四環(huán)素類、喹諾酮類等抗生素耐藥最普遍，對頭孢類、丁胺卡那及多粘菌素B等抗生素較為敏感，其中有2株對除多粘菌素B之外的所有抗生素均耐藥，其他菌株對19種抗生素均有不同程度的多重耐藥性，此耐藥情況與國內(nèi)其他地區(qū)大腸埃希菌耐藥情況相似[4，17-18]。

細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因有很多，通常與細(xì)菌本身特性、耐藥性基因的傳播和藥物的常規(guī)使用情況等因素有很大關(guān)系[19]。四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類等抗生素藥物是獸醫(yī)臨床常用藥物，不合理添加及無限制地濫用使得大腸埃希菌耐藥基因不斷出現(xiàn)，且有越來越嚴(yán)重的發(fā)展趨勢。

本試驗(yàn)從分離的22株豬源致病性大腸埃希菌中檢測出12種不同類型的耐藥基因型，其中四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB的檢出率均較高，表明這2種耐藥基因在四川地區(qū)豬源致病性大腸埃希菌中普遍存在，與國內(nèi)其他地區(qū)的研究結(jié)果相似[4，17]，且四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB的檢出率也與菌株對四環(huán)素類抗生素的耐藥率相符合，這一定程度上也反映出了耐藥基因型與耐藥表型之間的相關(guān)性?；前奉惸退幓騭ulⅠ、sulⅡ的檢出率也相對較高，與菌株對磺胺類抗生素藥物復(fù)方新諾明的高耐藥率表型也相符合。根據(jù)寇宏等[20]、翟晶[21]的研究報(bào)道，貴州省、浙江省豬源大腸埃希菌sulⅠ、sulⅡ耐藥基因的檢出情況較為嚴(yán)重，表明我國磺胺類耐藥基因攜帶率較高。氨基糖苷類耐藥基因acc(3)-Ⅱ、aph(3’)-Ⅱ的耐藥率分別為68.18%、50.00%，與河南地區(qū)的相關(guān)檢測數(shù)據(jù)一致性很高[4]，低于陳琳等[22]對豬腸道中氨基糖苷類耐藥基因acc(3)-Ⅱ、aph(3’)-Ⅱ的檢出率。本試驗(yàn)中，豬源大腸埃希菌氯霉素類耐藥基因floR的檢出率最高，其次是cmlA，這一結(jié)果與坤清芳等[23]研究的四川地區(qū)兔源大腸埃希菌floR的檢出率結(jié)果相差較大，表明即使在同一地區(qū)，不同來源的大腸埃希菌耐藥基因的攜帶情況也有顯著差異。喹諾酮類耐藥基因qnrB檢出率為40.91%，與閩西地區(qū)豬源大腸埃希菌喹諾酮類耐藥基因qnrB檢出率(37.8%)相似[24]，明顯高于犬源大腸埃希菌喹諾酮類耐藥基因的檢出率[25]，這一現(xiàn)象可能是由于喹諾酮類抗生素藥物廣泛添加到食品動物生產(chǎn)養(yǎng)殖中。β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM、SHV、OXA檢出率較低，與河南地區(qū)豬源大腸埃希菌β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的檢出率差異較大[4]，河北地區(qū)雞源大腸埃希菌β-內(nèi)酰胺類耐藥基因OXA攜帶率相似[26]。細(xì)菌耐受某種抗菌藥物常常與其攜帶一種或多種耐藥基因有關(guān)，所以耐藥基因的檢出率與其耐藥表型之間存在一定的差異。四川地區(qū)豬源致病性大腸埃希菌的耐藥基因型復(fù)雜，呈多重基因型共存。

相關(guān)研究表明，HPI毒力島在我國養(yǎng)殖場大腸埃希菌分離株中普遍存在[27]。本試驗(yàn)中，HPI毒力島基因irp1、irp2、fyuA檢出率分別為40.91%、13.64%、13.64%，其中3株大腸埃希菌同時(shí)攜帶irp1、irp2、fyuA等3種HPI毒力島基因及多種耐藥基因。菌株同時(shí)攜帶多種毒力基因和耐藥基因，可能使得其引發(fā)的疾病更加難以預(yù)防和治療，對畜禽及人類造成的危害更加嚴(yán)重，應(yīng)引起重視。