張安世，龐金城，劉 瑩，高登濤，魏志峰，*

(1.焦作師范高等專(zhuān)科學(xué)校 理工學(xué)院，河南 焦作454000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹(shù)研究所，河南 鄭州 450009)

葡萄(VitisviniferaL.)是栽培最早、分布最廣的果樹(shù)之一，全球葡萄共有70多個(gè)種、約14 000個(gè)品種[1]。其中，玫瑰香系是葡萄品種的一個(gè)重要系列。玫瑰香系葡萄是由國(guó)內(nèi)外育種工作者利用玫瑰香葡萄選育的系列品種，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前大約有76個(gè)品種。我國(guó)育種工作者用玫瑰香作親本共育成了56個(gè)葡萄品種，已成為我國(guó)葡萄育種中的骨干親本[2]。目前，全球的葡萄業(yè)產(chǎn)值已位居世界農(nóng)產(chǎn)品第5位[3]。葡萄也是我國(guó)發(fā)展速度最快的果樹(shù)種類(lèi)之一，玫瑰香系葡萄更是以其特有的玫瑰香味且果粒大等特點(diǎn)深受廣大消費(fèi)者喜歡和育種工作者的偏愛(ài)。隨著玫瑰香系葡萄新品種的不斷選育，品種系譜也不斷延伸，加上地區(qū)間的品種交流日益頻繁，“同名異物”或“同物異名”的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因此，需要理想的鑒定技術(shù)快速、準(zhǔn)確地區(qū)分表型極為相似的品種。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征、同工酶譜等手段容易受環(huán)境條件和組織發(fā)育階段的影響，在品種鑒定中有很大的局限性。由于DNA分子標(biāo)記不受環(huán)境因子和時(shí)空條件影響，具有高效、快捷等優(yōu)點(diǎn)，可直接反映品種間的遺傳差異，已成為品種鑒定的有效方法之一。Inter-primer binding site (iPBS)是Kalendar等[4]提出的以LTR類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增的一種分子標(biāo)記技術(shù)，無(wú)需預(yù)先獲知相關(guān)的LTR序列，比常規(guī)的分子標(biāo)記技術(shù)更有優(yōu)勢(shì)[5]。目前，簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增(ISSR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)等分子標(biāo)記技術(shù)在葡萄中均有成功應(yīng)用。研究表明，iPBS的多態(tài)性高于ISSR[6]，比AFLP更易操作[7]，比SSR成本更低，已逐漸應(yīng)用于種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和品種鑒定[8-9]，在葡萄中也得到了初步應(yīng)用[10-11]。為進(jìn)一步了解玫瑰香系葡萄的遺傳關(guān)系，本研究利用iPBS標(biāo)記并結(jié)合已有系譜[2，12]，對(duì)39個(gè)玫瑰香系葡萄品種進(jìn)行多樣性分析，建立DNA指紋圖譜，為葡萄種質(zhì)資源的鑒定、品種的保護(hù)利用等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的39個(gè)玫瑰香系葡萄種質(zhì)材料由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所葡萄種質(zhì)資源圃提供(表1)。每個(gè)品種選取3株，每株采集2枚健康的幼葉，分別用封閉的塑料袋包裝，保存于冰盒，及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存、備用。

1.2 葡萄基因組DNA的提取

每份材料取3枚不同植株的葉片等量混合，采用改良CTAB法[13]提取葡萄基因組DNA，用TE緩沖液將模板DNA濃度稀釋至20 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 iPBS-PCR擴(kuò)增

選用Kalendar等[4]發(fā)表的83個(gè)iPBS引物對(duì)供試材料進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體積10 μL，包含1.0 μL DNA、1.0 μL引物、5.0 μL 2×TaqMasterMix和3.0 μL RNase-Free water。iPBS-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，50 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，4 ℃保存。電泳采用1.5%瓊脂糖凝膠分離擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)分析電泳圖譜上清晰可辨的條帶，在電泳遷移率的相同位置上，用“1”或“0”分別代表?xiàng)l帶的“有”或“無(wú)”，構(gòu)建1/0矩陣。利用POPGENE1.32軟件計(jì)算相關(guān)遺傳多樣性參數(shù)[多態(tài)性百分率(PPL)、觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性(H)和Shannon’s多樣性指數(shù)(I)]。各引物的多態(tài)性信息含量(PIC)參照黃秀等[14]的方法計(jì)算，DNA指紋圖譜參考張林等[15]的方法繪制，用NTSYS-pc 2.0軟件構(gòu)建UPGMA聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 iPBS引物篩選與多態(tài)性分析

利用83個(gè)iPBS引物對(duì)39個(gè)玫瑰香系葡萄品種進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，篩選出了14條多態(tài)性高、重復(fù)性好、條帶清晰的引物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示(表2)：14個(gè)引物共擴(kuò)增出152個(gè)條帶，其中132條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為86.86%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增的位點(diǎn)總數(shù)為10.86個(gè)。引物2076的擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖1。各引物的PIC的變化范圍為0.796 5～0.914 9，平均值為0.863 8，說(shuō)明所選引物在39個(gè)玫瑰香系葡萄品種間具有較高的多態(tài)性。觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息指數(shù)(I)的平均值分別為1.868 4、1.409 0、0.251 8和0.390 7，也處于較高水平。利用SPSS 17.0軟件對(duì)PIC、Ne、H和I進(jìn)行了非參數(shù)Kruskal Wallis Test獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，結(jié)果表明：39個(gè)玫瑰香系葡萄種質(zhì)間遺傳多樣性水平存在顯著性差異(X2=49.945，P﹤0.00 1)。

表1 供試材料

Table1Grape materials used in study

序號(hào)No.品種名稱(chēng)Cultivarnames品種類(lèi)型Cultivartype親本來(lái)源Directparents1鄭州早紅Zhengzhouzaohong歐亞種V.vinifera玫瑰香×莎巴珍珠MuscatHamburgh×PearlofCsaba2蓓蕾Beilei歐美雜交種Euro-Americanhybrids不詳U(kuò)nknown3蓓蕾玫瑰Beileimeigui歐美雜交種Euro-Americanhybrids玫瑰香×蓓蕾M(fèi)uscatHamburgh×Beilei4脆紅Cuihong歐美雜交種Euro-Americanhybrids玫瑰香×白香蕉MuscatHamburgh×Baiixiangjiao5貴妃玫瑰Guifeimeigui歐美雜交種Euro-Americanhybrids紅香蕉×葡萄園皇后Hongxiangjiao×Putaoyuanhuanghou6黑香蕉Heixiangjiao歐美雜交種Euro-Americanhybrids紅香蕉×葡萄園皇后Hongxiangjiao×Putaoyuanhuanghou7紅香蕉Hongxiangjiao歐美雜交種Euro-Americanhybrids玫瑰香×白香蕉MuscatHamburgh×Baiixiangjiao8紅雙味Hongshuangwei歐美雜交種Euro-Americanhybrids紅香蕉×葡萄園皇后♀Hongxiangjiao×Putaoyuanhuanghou♀9紅蓮子Honglianzi歐亞種V.vinifera玫瑰香×葡萄園皇后MuscatHamburgh×Putaoyuanhuanghou10巨玫瑰Jumeigui歐美雜交種Euro-Americanhybrids沈陽(yáng)玫瑰×巨豐Shenyangmeigui×Kyoho11康太Kangtai歐美雜交種Euro-Americanhybrids康拜爾早生Kangbaierzaosheng12康拜爾早生Kangbaierzaosheng歐美雜交種Euro-Americanhybrids早熟摩阿×(貝爾維臺(tái)×玫瑰香)Zaoshumoe×(Beierweitai×MuscatHamburgh)13山東大紫Shandongdazi歐亞種V.vinifera山東早紅Shandongzaohong14天使玫瑰香TTianshimeiguixiang歐美雜交種Euro-Americanhybrids不詳U(kuò)nknown15香悅Xiangyue歐美雜交種Euro-Americanhybrids沈陽(yáng)玫瑰×8001Shenyangmeigui×800116紫珍香Zizhenxiang歐美雜交種Euro-Americanhybrids沈陽(yáng)玫瑰×8001Shenyangmeigui×80011787-1歐亞種V.vinifera玫瑰香MuscatHamburgh18京秀Jingxiu歐亞種V.vinifera玫瑰香×紅無(wú)籽露MuscatHamburgh×Hongwuzilu19卡拉斯玫瑰Kalasimeigui歐亞種V.vinifera玫瑰香×卡拉斯♀20玫瑰香MuscatHamburgh歐亞種V.vinifera黑漢×亞歷山大BlauerTrollinger×MuscatofAlexandria21沈陽(yáng)玫瑰Shenyangmeigui歐美雜交種Euro-Americanhybrids玫瑰香MuscatHamburgh22勝利Shengli歐亞種V.vinifera玫瑰香×巴爾坎斯基MuscatHamburgh×Baerkansiji23香妃Xiangfei歐亞種V.vinifera(玫瑰香×莎巴珍珠)×緋紅(MuscatHamburgh×PearlofCsaba)×Feihong24意大利Yidali歐亞種V.vinifera玫瑰香×比坎♀MuscatHamburgh×Bikan25早瑪瑙Zaomanao歐亞種V.vinifera玫瑰香×京早晶MuscatHamburgh×Jingzaojing26澤玉Zeyu歐亞種V.vinifera玫瑰香×龍眼MuscatHamburgh×Longyan27澤香Zexiang歐亞種V.vinifera玫瑰香×龍眼MuscatHamburgh×Longyan28早熟玫瑰香Zaoshumeiguixiang歐亞種V.vinifera玫瑰香×莎巴珍珠MuscatHamburgh×PearlofCsaba29早玫瑰Zaomeigui歐亞種V.vinifera玫瑰香×莎巴珍珠MuscatHamburgh×PearlofCsaba308612歐美雜交種Euro-Americanhybrids鄭州早紅×巨峰Zhengzhouzaohong×Kyoho31愛(ài)神玫瑰Aishenmeigui歐亞種V.vinifera玫瑰香×京早晶MuscatHamburgh×Jingzaojing32博多白Boduobai歐亞種V.vinifera意大利×羅扎基Yidali×Luozhaji33斯帕漢堡Sipahanbao歐美雜交種Euro-Americanhybrids玫瑰香×康拜爾早生MuscatHamburgh×Kangbaierzaosheng34大粒玫瑰香Dalimeiguixiang歐亞種V.vinifera玫瑰香Meiguixiang35紅繭Hongjian歐亞種V.vinifera紅意大利×龍尼坤♀Hongyidali×Longnikun36紅高Honggao歐亞種V.vinifera意大利Yidali37紅旗特早玫瑰Hongqitezaomeigui歐亞種V.vinifera玫瑰香Meiguixiang38紅意大利Hongyidali歐亞種V.vinifera意大利Yidali39甲斐乙女Jiafeiyinv歐亞種V.vinifera蓓蕾玫瑰×甲斐路Beileimeigui×Jiafeilu

表2iPBS引物擴(kuò)增結(jié)果與多態(tài)性信息

Table2Results and polymorphism information of iPBS primers

引物Primer引物序列(5′→3′)Primersequence(5′→3′)TNPPL/%PICNaNeHI2076GCTCCGATGCCA11872.730.86881.72731.36260.22110.34172095GCTCGGATACCA131292.310.91491.92311.42310.26440.41362380CAACCTGATCCA151493.330.91001.93331.4560.27820.42702381GTCCATCTTCCA121083.330.87111.83331.34260.21480.33672386CTGATCAACCCA10770.000.79651.70001.22940.15700.26012392TAGATGGTGCCA10880.000.86071.80001.42900.25460.38802272GGCTCAGATGCCA9888.890.83391.88891.39270.24220.37572278GCTCATGATACCA111090.910.86031.90911.36500.23050.36102218CTCCAGCTCCGATTACCA8675.000.85971.75001.33220.21040.33102230TCTAGGCGTCTGATACCA10990.000.85441.90001.53060.29930.44712231ACTTGGATGCTGATACCA88100.000.80732.00001.52730.32050.48872239ACCTAGGCTCGGATGCCA1313100.000.88972.00001.48220.30260.47022395TCCCCAGCGGAGTCGCCA10880.000.85961.80001.46570.27140.40792399AAACTGGCAACGGCGCCA121191.670.90571.91671.37400.24500.3912總計(jì)Total15213212.092620.06574.62965.26985.4399平均Mean10.8686.860.86381.86841.40900.25180.3907

T，位點(diǎn)總數(shù)；N，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)；PPL，多態(tài)性位點(diǎn)百分率；PIC，多態(tài)性信息含量；Na，觀測(cè)等位基因數(shù)；Ne，有效等位基因數(shù)；H，Nei’s基因多樣性；I，Shannon信息指數(shù)。

T， Total number of loci;N， Number of polymorphic loci;PPL， Percentage of polymorphic loci;PIC， Polymorphism information content;Na， Observed number of alleles;Ne， Effective number of alleles;H， Nei’s gene diversity;I， Shannon information index.

M，標(biāo)準(zhǔn)分子量；1～39，材料編號(hào)同表1。M， DL 2 000 standard marker; No.1-39 were the same as table 1.

2.2 玫瑰香系葡萄種質(zhì)資源的聚類(lèi)分析

利用NTSYS-pc 2.0軟件構(gòu)建了39個(gè)玫瑰香系葡萄品種的聚類(lèi)圖(圖2)，遺傳相似性系數(shù)(GS)為0.526 3～0.940 8，變幅達(dá)0.413 5，說(shuō)明39個(gè)玫瑰香系葡萄品種間存在較大的遺傳差異。在GS為0.72處，可將39個(gè)玫瑰香系葡萄品種為4組。第Ⅰ組包括26個(gè)品種，分別為鄭州早玉、早玫瑰、87-1、脆紅、玫瑰香、沈陽(yáng)玫瑰、大粒玫瑰香、勝利、天使玫瑰香、香悅、紫珍香、紅繭、香妃、意大利、紅高、紅意大利、博多白、甲斐乙女、早熟玫瑰香、卡拉斯玫瑰、早瑪瑙、澤玉、澤香、愛(ài)神玫瑰、紅旗特早玫瑰和京秀；第Ⅱ組包括6個(gè)品種，分別為蓓蕾、貴妃玫瑰、黑香蕉、紅雙味、紅香蕉和紅蓮子；第Ⅲ組包括6個(gè)品種，分別為巨玫瑰、康拜爾早生、康太、山東大紫、8612和斯帕漢堡；第Ⅳ組僅有蓓蕾玫瑰1個(gè)品種。其中，第Ⅰ組有5個(gè)歐美雜交種，21個(gè)歐亞種，第Ⅱ組有5個(gè)歐美雜交種和1個(gè)歐亞種，第Ⅲ組有5個(gè)歐美雜交種和1個(gè)歐亞種，第Ⅳ組蓓蕾玫瑰為歐美雜交種。從上述結(jié)果可知，歐亞種主要分布Ⅰ組，而歐美雜交種主要分布在第Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組。如果再將第Ⅰ組細(xì)分，可以分為5個(gè)小組。其中，第1組分布5個(gè)歐美雜交種(脆紅、沈陽(yáng)玫瑰、天使玫瑰香、香悅和紫珍香)和6個(gè)歐亞種(鄭州早玉、早玫瑰、87-1、玫瑰香、大粒玫瑰香和勝利)，其余4個(gè)小組全為歐亞種，共計(jì)15個(gè)品種。

1～39材料編號(hào)同表1。No. 1-39 were the same as table 1.

2.3 DNA指紋圖譜的構(gòu)建

根據(jù)篩選的14個(gè)引物對(duì)玫瑰香系葡萄的擴(kuò)增結(jié)果，選取2076、2095、2380、2392、2272、2278、2218和2231共8個(gè)引物擴(kuò)增的16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，構(gòu)建了39個(gè)玫瑰香系葡萄品種的DNA指紋圖譜(圖3)。其中，部分品種較難區(qū)分，它們之間僅1個(gè)位點(diǎn)的差異。如康太與8612[(2272)-1288 bp]、玫瑰香與大粒玫瑰香[(2231)-873 bp]、意大利與博多白[(2231)-873 bp]、澤玉與澤香[(2218)-1296bp]。此圖譜可以有效區(qū)分39個(gè)玫瑰香系葡萄品種。

1-39材料編號(hào)同表1。No. 1-39 were the same as table 1。

3 討論

3.1 玫瑰香系葡萄品種的遺傳多樣性分析

通過(guò)iPBS標(biāo)記分析可知：39個(gè)玫瑰香系葡萄品種的多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPL)為86.86%，高于丁潔菲等[16]74%的檢測(cè)結(jié)果，與李琳等[17]、王發(fā)明等[18]的研究結(jié)果類(lèi)似，但低于李雪雁等[19]和郭印山等[20]的100%的檢測(cè)結(jié)果。這種現(xiàn)象可能是由于不同研究者采用的分子標(biāo)記類(lèi)型不同、研究對(duì)象的種類(lèi)和數(shù)量各異等因素所致。同時(shí)，iPBS分析得到的PIC平均值較高(0.863 8)，說(shuō)明本研究篩選的引物具有很高的多態(tài)性。另外，從評(píng)價(jià)遺傳多樣性水平的其他4個(gè)主要參數(shù)Na、Ne、H和I來(lái)看，其平均值分別為1.868 4、1.409 0、0.251 8和0.390 7，也處于較高水平。品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)為0.526 3～0.940 8，變幅(0.413 5)較大。上述結(jié)果說(shuō)明，39個(gè)玫瑰香系葡萄品種間具有較為豐富的遺傳變異，同時(shí)也說(shuō)明，在玫瑰香系葡萄不斷的人工定向雜交選育過(guò)程中其遺傳多樣性仍維持在較高水平。

3.2 玫瑰香系葡萄品種的聚類(lèi)分析

本研究中的39個(gè)玫瑰香系葡萄品種，共涉及歐美雜交種(16個(gè))和歐亞種(23個(gè))2個(gè)類(lèi)群。聚類(lèi)分析結(jié)果表明：在遺傳相似系數(shù)(GS)為0.72處可將39個(gè)玫瑰香系葡萄品種分為4組。其中歐亞種群主要分布在第Ⅰ組，而歐美雜交種群主要分布在第Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組。在第Ⅰ組中除第1小組出現(xiàn)歐美雜交種和歐亞種互插外，其他4個(gè)小組全為歐亞種，分布相對(duì)集中。因此，從整體來(lái)看，2個(gè)類(lèi)群的玫瑰香系葡萄分布呈現(xiàn)一定規(guī)律。將此聚類(lèi)結(jié)果與系譜[12]對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，兩者基本吻合。例如玫瑰香與莎巴珍珠的雜交后代鄭州早紅與早玫瑰聚在了一起；沈陽(yáng)玫瑰香和大粒玫瑰香是通過(guò)玫瑰香芽變選育的品種，三者具有很大的相似性，聚在一起；紫珍香和香悅是沈陽(yáng)玫瑰香與8001雜交選育的后代，兩者聚在一起，且與玫瑰香、沈陽(yáng)玫瑰香和大粒玫瑰香一起聚在第Ⅰ組第1小組的一個(gè)分支；第Ⅰ組第2小組分布7個(gè)玫瑰香系葡萄品種，除香妃和甲斐乙女外，其余5個(gè)品種(紅繭、意大利、紅高、紅意大利和博多白)是意大利和通過(guò)意大利選育的品種，顯示出很近的親緣關(guān)系；另外，黑香蕉、貴妃玫瑰和紅雙味是通過(guò)紅香蕉選育的后代，這4個(gè)品種聚在一起；澤玉和澤香是玫瑰香和龍眼的雜交后代，它們也聚在了一起。因此，該聚類(lèi)分析能較好地反映玫瑰香系葡萄品種間的遺傳關(guān)系。說(shuō)明iPBS分子標(biāo)記技術(shù)在葡萄的遺傳多樣性研究中是可行的。但是，該聚類(lèi)結(jié)果也出現(xiàn)了與系譜不一致的現(xiàn)象。如愛(ài)神玫瑰和早瑪瑙是玫瑰香與京早晶的雜交后代，兩者未能聚在一起；早玫瑰香、鄭州早紅和早玫瑰具有相同的親本卻未能聚在一起。另外，從系譜分析，蓓蕾、蓓蕾玫瑰和甲斐乙女應(yīng)該具有較近的親緣關(guān)系，但聚類(lèi)分析未能有效顯示。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能的原因，一是引物數(shù)量較少，檢測(cè)位點(diǎn)不足；另一方面，iPBS標(biāo)記自身也有一定的局限性，任何一種分子標(biāo)記都無(wú)法覆蓋全基因組序列。因此，需要結(jié)合形態(tài)學(xué)和其他分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行深入研究，為玫瑰香系葡萄種質(zhì)遺傳多樣性與品種的鑒定提供更多的分子依據(jù)。

3.3 iPBS標(biāo)記在種質(zhì)資源鑒定上的應(yīng)用

依據(jù)植物的形態(tài)學(xué)特征很難區(qū)分表型特征極為相似的品種，而DNA分子標(biāo)記可直接反映品種間的遺傳差異，已成為品種鑒定的有效方法之一。iPBS標(biāo)記在植物品種鑒定方面已有成功應(yīng)用。石艷艷[10]利用15個(gè)iPBS引物對(duì)巨峰及其芽變品種峰早和京亞及其芽變品種洛浦早生的頂端分生組織細(xì)胞原層(LⅡ?qū)?、LⅠ+ LⅡ?qū)舆M(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示，上述2個(gè)早熟芽變品種的LⅡ?qū)影l(fā)生了變化，為親本及其芽變品種的鑒定提供了一種新的方法。王文婷[21]利用8個(gè)iPBS引物產(chǎn)生的特異性條帶對(duì)12個(gè)楊梅品種進(jìn)行了有效鑒定。李嬋等[22]利用11個(gè)擴(kuò)增效果較好的iPBS引物，對(duì)47份菌草種質(zhì)材料進(jìn)行了有效區(qū)分。本研究通過(guò)iPBS技術(shù)，利用8個(gè)引物擴(kuò)增的16個(gè)多態(tài)性高、重復(fù)性好的特異性位點(diǎn)構(gòu)建了39個(gè)玫瑰香系葡萄品種的DNA指紋圖譜，為后續(xù)葡萄種質(zhì)間的大規(guī)模鑒定與評(píng)價(jià)提供了理論支撐。