馮 濤， 桑 敏， 莊海寧， 孫 敏， 徐志民， 王旭增

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所/國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海201403；3.路易斯安那州立大學(xué) 營(yíng)養(yǎng)與食品科學(xué)學(xué)院，LA 70803，美國(guó)）

銀杏（Gingko，Gingko bilobaL.）是我國(guó)珍貴樹種之一，果實(shí)中富含淀粉、維生素、蛋白質(zhì)以及多種氨基酸[1]。除此之外，果實(shí)中含有黃酮類及內(nèi)酯類化合物等生物活性成分，能夠降血脂、促進(jìn)血液循環(huán)及清除自由基，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益及藥用價(jià)值[2]。但是目前對(duì)于銀杏果的深加工還處在初始階段，在釀酒行業(yè)的應(yīng)用主要體現(xiàn)在銀杏葉提取物參與酒精發(fā)酵以及銀杏果釀造白酒上[3-4]，對(duì)于銀杏果應(yīng)用于葡萄酒行業(yè)的還未見報(bào)道。因此以葡萄酒為依托，開發(fā)一種新型葡萄酒，既可以豐富葡萄酒的種類，又可以延長(zhǎng)銀杏產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，提高其經(jīng)濟(jì)附加值。

葡萄酒的風(fēng)味特征在很大程度上影響葡萄酒品質(zhì)好壞和消費(fèi)者喜好。葡萄酒的香氣是評(píng)判其品質(zhì)的一項(xiàng)重要感官指標(biāo)，決定了葡萄酒風(fēng)味的典型性[5]。葡萄酒中的香氣成分具有種類復(fù)雜、含量低、不穩(wěn)定等特點(diǎn)，因此對(duì)樣品進(jìn)行萃取和濃縮十分必要。目前常用的香氣化合物萃取方法主要有液-液萃取、固相萃取、同時(shí)蒸餾萃取以及頂空固相微萃取 （Headspace solid phase microextraction，HSSPME）等，其中HS-SPME具有操作簡(jiǎn)單、環(huán)保、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。目前許多學(xué)者采用該方法測(cè)定酒的香氣成分。Sagratini[8]等人采用HS-SPME結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）技術(shù)測(cè)定了蒙特普齊亞諾紅葡萄酒中的香氣成分，共檢測(cè)到28種香氣成分，其中酯類物質(zhì)含量最高，主要為酒體提供花香和果香香氣。Welke[9]等人采用HS-SPME結(jié)合GC×GC/TOFMS對(duì)霞多麗葡萄酒的揮發(fā)性組分進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，共檢出243種揮發(fā)性成分，化合物種類明顯多于一維GC所檢出的。

作者選用HS-SPME方法萃取銀杏葡萄酒中的香氣物質(zhì)。為了更好地研究葡萄酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，作者在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，最終確定了香氣成分的最佳的萃取條件。并結(jié)合GC-MS分析銀杏葡萄酒中的香氣成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄（VitisL）：購(gòu)于上海奉賢區(qū)海灣區(qū)葡萄種植園；銀杏果（Gingko bilobaL.）：購(gòu)于上海市奉賢區(qū)樂購(gòu)超市；酵母：安琪酵母有限公司產(chǎn)品；2-辛醇（色譜純）和 C7-C30正構(gòu)烷烴 （色譜純）：Dr.EhxenstorferGmbH公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀（Agilent 6890型）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC 7890A-5975C型）：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；萃取手柄、50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭：美國(guó)Supelco公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 銀杏葡萄酒釀造工藝流程

1.3.2 主要理化指標(biāo)的測(cè)定 殘?zhí)橇浚偺牵⒁掖俭w積分?jǐn)?shù)、總還原糖、揮發(fā)酸，游離二氧化硫含量、總酸的測(cè)定方法參照GB/T 15038—2006[10]；總酚含量及抗氧化活性測(cè)定參照王旭[6]等的方法測(cè)定。

1.3.3 萃取條件的單因素實(shí)驗(yàn) 采用50/30 μmDVB/CAR/PDMS萃取頭，以一定量的葡萄酒酒樣加到15 mL頂空萃取瓶中，加入10 μL 2-辛醇（400 mg/L），磁力加熱攪拌器上平衡15 min，水浴加熱萃取，GC解析5 min為不變因素，選取萃取溫度、萃取時(shí)間和取樣量3個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)：萃取溫度設(shè)定為40～65℃，以5℃為梯度、萃取時(shí)間設(shè)定為20～55 min，以5 min為梯度、取樣量為3～9 mL，以1 mL為梯度。并以色譜總峰面積（色譜總峰面積是指包括內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)的檢出的所有化合物的峰面積總和）為響應(yīng)值。

1.3.4 萃取條件的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定HS-SPME法萃取銀杏葡萄酒香氣成分的最佳萃取條件。

1.3.5 GC檢測(cè)條件 毛細(xì)管色譜柱型號(hào)：Agilent HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；采用不分流進(jìn)樣模式；程序升溫：初溫50℃保持2 min，以6℃/min升溫至150℃，再以3℃/min 升溫至 230 ℃，保持 5 min；載氣：氮?dú)猓∟2），流量 0.8 mL/min；燃?xì)猓簹錃猓℉2），流量 30 mL/min；助燃?xì)猓嚎諝?，流?00 mL/min；檢測(cè)器（FID）溫度：250℃。 每個(gè)樣品重復(fù) 3次平行[6，11]。

1.3.6 GC-MS檢測(cè)條件 毛細(xì)管色譜柱型號(hào)：Agilent HP-INNOWAX （60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；采用不分流進(jìn)樣模式；程序升溫：初溫50℃保持2 min，以6℃/min升溫至150℃，再以3℃/min升溫至230℃，保持5 min；載氣：氦氣（He），流量 1.0 mL/min；電離子源 EI，電子能量70 eV；離子源溫度250℃，質(zhì)譜接口溫度250℃，掃描范圍m/z30～450。 每個(gè)樣品重復(fù) 3次平行[6，11]。

1.3.7 香氣物質(zhì)的定性定量分析 香氣成分的定性通過：與質(zhì)譜的Wiley和NIST 05譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)；與標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)（RI）值進(jìn)行比對(duì)，沒有標(biāo)準(zhǔn)品的，與已報(bào)道的文獻(xiàn)中的RI值進(jìn)行比對(duì)。保留指數(shù)根據(jù)計(jì)算得到，按照樣品的分析方法，將C7-C30的正構(gòu)烷烴混標(biāo)注入GC-MS進(jìn)行分離，通過烷烴混標(biāo)的保留時(shí)間來計(jì)算未知化合物的RI[11-12]。

香氣成分的定量分析通過內(nèi)標(biāo)物2-辛醇進(jìn)行定量分析。

同時(shí)計(jì)算待測(cè)物的OAV值來表征某種香氣化合物對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中采用Design-expert 7.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸分析。使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酒樣理化指標(biāo)比較

比較兩種不同的酒樣可以看出，銀杏葡萄酒酒樣的酒精度、總糖及總還原糖的質(zhì)量濃度均顯著高于不添加銀杏酶解液的葡萄酒酒樣，這是由于加入酶解液導(dǎo)致總體系中的可發(fā)酵糖含量增多，從而導(dǎo)致酒精度增大且總糖及總還原糖含量增大。且對(duì)于總酚含量、DPPH及ABTS自由基清除活性，兩種酒樣之間存在顯著性差異，且銀杏葡萄酒酒樣的總酚含量及自由基清除活性顯著高于葡萄酒酒樣。

2.2 萃取條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 萃取溫度的影響 萃取溫度對(duì)葡萄酒香氣成分萃取的影響如圖1所示。

頂空固相微萃取方法中，萃取溫度對(duì)于萃取效果具有較大的影響[12]。如圖1，萃取溫度在40～65℃范圍內(nèi)，色譜總峰面積隨著溫度升高而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，原因是隨溫度的升高，氣體分子的熱運(yùn)動(dòng)加快，有利于揮發(fā)性物質(zhì)揮發(fā)出來吸附到纖維萃取頭上，從而能夠縮短達(dá)到吸附平衡的時(shí)間，然而溫度過高又會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性物質(zhì)與萃取頭纖維涂層之間的分配系數(shù)降低[13]，從而又降低了吸附量。綜合來說，萃取溫度為55℃時(shí)，萃取效果較好，因此存在最佳值。

圖1 萃取溫度對(duì)葡萄酒香氣成分萃取的影響Fig.1 Effect of temperature of extraction on aroma compounds of wine

2.2.2 萃取時(shí)間的影響 萃取時(shí)間對(duì)葡萄酒香氣成分萃取的影響如圖2所示。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)葡萄酒香氣成分萃取的影響Fig.2 Effect of time of extraction on aroma compounds of wine

頂空固相微萃取的最佳萃取時(shí)間是指揮發(fā)性物質(zhì)在樣品、頂空基質(zhì)和萃取頭纖維涂層之間的分配達(dá)到平衡狀態(tài)所需要的時(shí)間[13-14]。如圖2，在萃取時(shí)間20～55 min范圍內(nèi)，色譜總峰面積隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出先快速增大后緩慢減小的趨勢(shì)，在40 min時(shí)達(dá)到最大，存在最佳值，隨后開始緩慢減小，原因可能是由于涂層上香氣化合物的吸附量在萃取初始階段迅速增加，但隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，萃取頭纖維涂層上的吸附量達(dá)到飽和，萃取時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性組分發(fā)生解析，且有些熱不穩(wěn)定性的組分發(fā)生分解?？紤]到實(shí)際實(shí)驗(yàn)的實(shí)施性以及能源損耗，選取萃取時(shí)間為40 min。

2.2.3 取樣量的影響 取樣量對(duì)葡萄酒香氣成分萃取的影響如圖3所示。

圖3 取樣量對(duì)葡萄酒香氣成分萃取的影響Fig.3 Effect of sample volume on aroma compounds of wine

取樣量會(huì)影響樣品瓶中氣相和液相的體積比，從而影響香氣物質(zhì)在兩相間的分配比，進(jìn)而影響萃取結(jié)果[15-16]。如圖3，在取樣量為3～9 mL范圍內(nèi)，隨著取樣量的增加，色譜總峰面積先是呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，在6 mL以后趨于平緩，說明取樣量存在最佳點(diǎn)。原因在于，取樣量過少時(shí)，揮發(fā)性組分頂空到萃取頭涂層的質(zhì)量濃度小，萃取涂層的吸附量也較??；隨著取樣量的增加，涂層的吸附量逐漸增多，但是取樣量過多時(shí)，一方面可能液面會(huì)接觸到萃取頭，污染涂層，另一方面可能導(dǎo)致水浴加熱時(shí)受熱不均勻，從而揮發(fā)性組分不能較好的揮發(fā)出來，因此，選取取樣量為6 mL。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[17]，以萃取溫度、萃取時(shí)間以及取樣量為自變量，以色譜總峰面積（Y）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平見表1。實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table1 Analytical factors and levels for RSA

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table2 Program and experimental results of RSA

2.3.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，擬合得到多元二次回歸模型：

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table3 Regression equation and rariance analysis for the experimental results

由表 4 知，該模型P＜0.0001＜0.01，表示該模型極顯著；且失擬項(xiàng)P=0.57＞0.05，說明模型失擬項(xiàng)不顯著；回歸模型擬合度R2=0.9862，說明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值具有較好的相關(guān)性，校正擬合度R2Adj=0.9690，說明模型擬合度良好，可以用來預(yù)測(cè)HS-SPME銀杏葡萄酒香氣組分的最佳條件。對(duì)模型的回歸方程進(jìn)行分析可知：B、AC、A2、B2、C2項(xiàng)P值均小于0.01，為極顯著；A項(xiàng)P值大于0.01小于0.05，為顯著，其他項(xiàng)均為不顯著，因此可知各因素之間影響大小依次為：萃取時(shí)間＞萃取溫度＞取樣量。

2.3.3 萃取條件對(duì)萃取效果的影響 圖4是色譜總峰面積對(duì)萃取溫度、萃取時(shí)間和取樣量?jī)蓛梢蛩亟换プ饔玫?D圖及其等高線圖[17-18]。

從圖4中可以看出，萃取溫度和取樣量對(duì)總峰面積的影響最大，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面較陡，這與方差分析的結(jié)果基本一致。如圖4（a），在因素所考察的范圍內(nèi)，隨著萃取溫度的升高，總峰面積呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，55℃為轉(zhuǎn)折點(diǎn)；隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先快速增大后緩慢減小的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)折點(diǎn)為42 min。如圖4（b），總峰面積隨溫度的升高呈現(xiàn)迅速上升后略有下降的趨勢(shì)，隨取樣量的增大，總峰面積亦呈現(xiàn)迅速上升趨勢(shì)，但較萃取溫度平緩，且響應(yīng)面投影的等高線圖為橢圓，說明兩者的交互作用較為顯著，這與方差分析的結(jié)果也基本一致。如圖4（c），萃取時(shí)間與取樣量對(duì)總峰面積的影響呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，但取樣量的影響較為平緩。

結(jié)合方差分析以及回歸方程的響應(yīng)面3D圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，此時(shí)對(duì)應(yīng)的理論萃取條件為：萃取溫度55.42℃，萃取時(shí)間41.48 min，取樣量為6.01 mL。為了實(shí)驗(yàn)實(shí)施的可行性及方便性，取萃取溫度55℃，萃取時(shí)間42 min，取樣量6 mL，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)證實(shí)，實(shí)際總峰面積占預(yù)測(cè)值的89.28%。說明該模型可較好地反映葡萄酒香氣物質(zhì)檢測(cè)時(shí)HS-SPME的條件[19]。

圖4 萃取溫度、萃取時(shí)間與取樣量交互作用的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface graph of total peak area as a function of extraction temperature，extraction time and sampling volume

2.4 銀杏葡萄酒香氣成分的GC-MS分析

以上述響應(yīng)面法優(yōu)化確定的萃取條件對(duì)銀杏葡萄酒進(jìn)行香氣組分萃取并結(jié)合GC-MS分析。共檢測(cè)到了31種香氣物質(zhì)，包括醇類、酯類、酸類、羰基類以及酚類化合物。香氣活性值（OAV）可以用于評(píng)價(jià)一種香氣物質(zhì)對(duì)酒香氣的貢獻(xiàn)大小[28]。

酯類物質(zhì)是主要的香氣物質(zhì)，共檢出15種，總質(zhì)量質(zhì)量為511.38 mg/L，占總揮發(fā)性物質(zhì)質(zhì)量濃度的65.94%。葡萄酒中的酯類物質(zhì)主要來源于酵母在生物合成或陳釀過程中的酯化反應(yīng)，是氨基酸或碳水化合物降解產(chǎn)生的高級(jí)醇與乙酰輔酶A的反應(yīng)產(chǎn)物[29-30]。其中，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、辛酸乙酯、乙酸甲酯和己酸乙酯的含量較高。乙酸乙酯產(chǎn)生令人愉悅的果香香氣，辛酸乙酯產(chǎn)生菠蘿、梨子的香甜香氣[29]。酯類物質(zhì)的OAV值均大于1，說明檢出的酯類香氣物質(zhì)幾乎都對(duì)酒香氣具有貢獻(xiàn)作用，其中，乙酸異戊酯、己酸乙酯、乙酸乙酯等的OAV值較大，且主要產(chǎn)生成熟的果香香氣[29]，說明這幾種物質(zhì)對(duì)銀杏葡萄酒的香氣產(chǎn)生關(guān)鍵性作用。

醇類物質(zhì)含量?jī)H次于酯類，葡萄酒中的醇類主要來源于酵母菌的新陳代謝，主要有兩種形成途徑：葡萄糖合成代謝途徑和氨基酸分解代謝途徑[29，31]。有文獻(xiàn)報(bào)道[32]，醇類物質(zhì)的質(zhì)量濃度低于300 mg/L時(shí)，對(duì)酒產(chǎn)生理想的香氣。共檢出8種醇類，總質(zhì)量濃度為162.16 mg/L，占總檢出化合物的20.91%，其中異戊醇最高，其次是苯乙醇、異丁醇和芳樟醇等。8種化合物中除丙醇和苯甲醇，其他化合物的OAV值均大于1。其中，芳樟醇OAV值最大，產(chǎn)生薰衣草花香香氣[33]，其次苯乙醇產(chǎn)生玫瑰的甜香香氣[34]。

酸類物質(zhì)可能來源于葡萄中飽和脂肪酸的自動(dòng)氧化反應(yīng)[35]，酸類物質(zhì)能夠產(chǎn)生果香、奶酪香氣、脂肪香，還可能產(chǎn)生腐臭味短鏈脂肪酸一般具有芳香酸香氣和腐臭味，會(huì)掩蓋掉酒體特有的香氣，因此，適宜的揮發(fā)酸質(zhì)量濃度較為重要，但隨著揮發(fā)酸濃度的增大，可能會(huì)對(duì)酒體香氣產(chǎn)生負(fù)面作用。在銀杏葡萄酒中共檢出酸類物質(zhì)3種：乙酸、戊酸和2-甲基丁酸。酸類物質(zhì)總質(zhì)量濃度為26.64 mg/L，占總揮發(fā)性組分的3.43%。這些酸類物質(zhì)可能對(duì)于銀杏葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)較小，因?yàn)樗鼈兙哂休^高的香氣檢測(cè)閾值。

在銀杏葡萄酒中還檢測(cè)到了4種羰基類化合物。羰基類化合物包括醛類物質(zhì)和酮類物質(zhì)。羰基類化合物主要來源于酒中的不飽和脂肪酸或氨基酸的降解，氨基酸的部分降解產(chǎn)物可形成高級(jí)醇，這些高級(jí)醇在氧氣存在的條件下可以轉(zhuǎn)化為醛和酮。且僅游離態(tài)的醛能夠在低質(zhì)量濃度時(shí)產(chǎn)生水果果香香氣，而在高質(zhì)量濃度（>200 mg/L）時(shí)，產(chǎn)生單調(diào)的香氣。乙醛能夠產(chǎn)生青草香氣和脂肪香，苯甲醛產(chǎn)生杏仁香和焦糖香。此外，醛類物質(zhì)在低質(zhì)量濃度水平時(shí)貢獻(xiàn)出令人愉悅的水果香氣，但是在高質(zhì)量濃度水平（>125 mg/L）時(shí)會(huì)影響葡萄酒的感官特性，會(huì)產(chǎn)生辛辣刺激性氣味。

除此之外，還檢測(cè)到一種酚類物質(zhì)，2，4-二叔丁基苯酚。酒樣中的揮發(fā)酚類物質(zhì)主要來源于香豆酸和阿魏酸的酶解或熱脫羧反應(yīng)。這類物質(zhì)主要產(chǎn)生辛辣、煙熏香氣，并且容易與其他芳香化合物產(chǎn)生協(xié)同作用。

3 結(jié)語(yǔ)

通過響應(yīng)面法優(yōu)化HS-SPME萃取葡萄酒中香氣物質(zhì)的條件，并采用SPME結(jié)合GC-MS技術(shù)測(cè)定銀杏葡萄酒中的揮發(fā)性成分組成。結(jié)果表明：HSSPME萃取銀杏葡萄酒香氣的最佳條件為：萃取溫度55℃、萃取時(shí)間42 min、取樣量6 mL。以此萃取條件并結(jié)合GC-MS分析測(cè)得銀杏葡萄酒香氣成分31種，其中種類最多且含量最高的是酯類物質(zhì)，通過OAV值的計(jì)算，其中有24種化合物的OAV值大于1，說明檢測(cè)到的31種物質(zhì)中基本上都對(duì)酒的風(fēng)味產(chǎn)生貢獻(xiàn)作用，尤其是異戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯以及乙醛等。