姜 威，孟利強(qiáng)，陳靖宇，曹 旭，胡基華，李 晶，張淑梅

(1.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院 高技術(shù)研究院，哈爾濱 150010)

芽孢桿菌廣泛存在于自然界中，是重要的生防資源菌。近年來，以芽孢桿菌為活性成分的微生物菌劑產(chǎn)品逐年遞增，在植病生防方面的作用日益凸顯。然而，這些活體菌劑在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)受到土壤中生物和非生物因素影響，存在應(yīng)用效果不穩(wěn)定的共性問題[1]。活體菌劑的生防效果與生防菌在土壤中的定殖能力相關(guān)[2]，生防菌株在土壤中定殖能力的下降會(huì)降低其田間防治效果[3-4]。研究表明，生防菌株在土壤中的定殖能力受到菌株自身特性和土壤環(huán)境因素的影響，Chen等[5]報(bào)道枯草芽孢桿菌生物膜的形成影響其根際定殖能力，缺失生物膜形成關(guān)鍵基因的突變株其定殖能力下降，對(duì)番茄細(xì)菌性枯萎病的防控效果也下降。韓騰[6]研究發(fā)現(xiàn)，Tpb55菌株在pH 6和pH 7的土壤中的定殖密度顯著高于其他pH土壤，并且Tpb55菌株不能在pH 3的土壤中定殖。王素芳等[7]發(fā)現(xiàn)，環(huán)境溫度30 ℃，土壤濕度為20%～25%時(shí)更利于生防菌S506的定殖。近年來，關(guān)于土壤的微生態(tài)環(huán)境對(duì)定殖影響的報(bào)道逐漸增多，但結(jié)果不盡相同。劉健等[8]發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌在滅菌土壤中的定殖數(shù)量高于未滅菌土壤中的定殖數(shù)量。曹璞[9]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉菌在一定程度上促進(jìn)了S.plymuthicaA21-4在辣椒和黃瓜根際土壤中的定殖。

芽孢桿菌在土壤中的豐度較大，如何區(qū)分引入的生防菌與土著菌是研究生防菌在土壤中定殖的關(guān)鍵技術(shù)。目前，抗生素標(biāo)記的選擇性平板計(jì)數(shù)法和基因標(biāo)記法是研究菌株根圍定殖常用方法[10]。然而，標(biāo)記后的菌株與野生菌株的生長特性存在很大差別，不能客觀反映野生菌的生長定殖動(dòng)態(tài)。

解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensTF28是黑龍江省基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期從大豆根部分離的內(nèi)生細(xì)菌，具有廣譜抗真菌活性，應(yīng)用前景廣闊[11-12]。本試驗(yàn)采用菌落形態(tài)鑒別活菌計(jì)數(shù)及菌株特異PCR驗(yàn)證相結(jié)合方法研究溫度、土壤類型、含水量、pH、病原菌及接種量對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響，探討菌株定殖量與防效相關(guān)性，為菌株的田間應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 生防菌株BacillusamyloliquefaciensTF28和大豆根腐病菌Fusariumoxysporum為黑龍江省科學(xué)院微生物研究所自行分離獲得，保存于黑龍江省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基(LB)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，水1 L，pH 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)e2SO40.01 g，MgSO40.5 g，水1 L，pH 7.2～7.4；菌數(shù)測定培養(yǎng)基(NYD)：牛肉膏8 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，水 1 L，pH 7.2；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，水1 L，pH 7.0。

1.1.3 土壤來源 土壤采自黑龍江加格達(dá)奇、同江和集賢健康大豆植株根圍土壤。

1.2 方 法

1.2.1 生防菌液制備 用接種環(huán)挑取-80 ℃下保存的TF28菌體劃線接種至LB平板，30 ℃過夜培養(yǎng)。次日取單菌落轉(zhuǎn)接于5 mL LB培養(yǎng)液中，30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，按體積分?jǐn)?shù)為2%接種量轉(zhuǎn)接到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中， 30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)30 h，測菌數(shù)后用無菌水稀釋至2×108cfu/mL，備用。

1.2.2 病原菌孢子懸浮液的制備 用PDA固體平板培養(yǎng)病原菌，28 ℃培養(yǎng)8～10 d后用無菌水洗滌孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)量，用無菌水稀釋成濃度為107cfu/mL的孢子懸浮液, 備用。

1.2.3 土壤樣品處理 供試土壤樣品自然風(fēng)干，研磨后室溫放置，備用。每個(gè)處理取10 g 土樣放至無菌培養(yǎng)皿中，按下述處理加入適量菌液，混拌均勻，用Parafilm膜封口后靜置。

1.2.4 土樣中生防菌數(shù)測定 采用平板菌落計(jì)數(shù)及菌株特異PCR驗(yàn)證相結(jié)合方法進(jìn)行菌數(shù)測定。取1 g土樣加到裝有10 mL無菌水的滅菌離心管中，振蕩1 min，制成土壤懸浮液，10倍濃度倍比稀釋至10-5。分別取10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液100 μL，涂布NYD平板，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h。根據(jù)菌株TF28在NYD上的特殊菌落形態(tài)計(jì)數(shù)并用菌株特異PCR進(jìn)行驗(yàn)證，按下述公式計(jì)算菌數(shù)。土壤含菌數(shù)量(cfu/g)=菌落數(shù)× 10×稀釋倍數(shù)。

1.2.5 溫度對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響 取10 g同江(pH 5.2)土樣加入2 mL的TF28菌液(2×108cfu/mL)，分別置于15 ℃、20 ℃、 25 ℃、30 ℃和35 ℃培養(yǎng)。每處理3個(gè)重復(fù)，以不加菌土樣為對(duì)照，分別于7 d、14 d、21 d和28 d取樣測定菌數(shù)。

1.2.6 土壤含水量對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響 將 2 mL菌液離心收集菌體，用無菌水適當(dāng)稀釋后加到10 g同江土樣中，使土壤含水量分別為5%、8%、15%、25%和35%。每處理3個(gè)重復(fù)，以不加菌土樣做對(duì)照，置于25 ℃培養(yǎng)，分別于7 d、14 d、21 d和28 d取樣測定菌數(shù)。

1.2.7 土壤pH對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響 取10 g同江土樣用NaOH或HCI溶液調(diào)土樣pH分別為4.5、5.4、6.2、7.0、7.8、8.6，取 2 mL菌液的菌體用無菌水稀釋后加入土壤中，使土壤含水量為15%。每處理置3個(gè)重復(fù)，以不加菌土樣做對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)，分別于7 d、14 d、 21 d和28 d取樣測定菌數(shù)。

1.2.8 接種量對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響 取10 g同江土樣，調(diào)土壤的pH為6.2，接種濃縮菌體，使接種量分別為5%、15%、20%和25%，調(diào)土壤含水量為15%。每處理3個(gè)重復(fù)，以不加菌土樣做對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)，分別于7 d、 14 d、21 d、28 d和35 d取樣測定菌數(shù)。

1.2.9 土壤類型對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響 取來源于加格達(dá)奇、同江和集賢大豆田的黑土，黑鈣土和草甸土，使土壤含水量為15%，接菌量為20%。每處理3個(gè)重復(fù)，以不加菌土樣做對(duì)照，置25 ℃培養(yǎng)，分別于7 d、14 d、21 d和 28 d取樣測定菌數(shù)。

1.2.10 病原菌對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響 取10 g加格達(dá)奇土樣，先加病原菌懸浮液使土壤病菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為105cfu/g，再加TF28菌液，調(diào)土壤含水量為15%，接菌量為20%，土壤pH為6.2，以不加病菌為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。分別于7 d、14 d、21 d和28 d取樣測定菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2007 軟件處理分析數(shù)據(jù)，用SAS 8.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響

菌株TF28在5個(gè)溫度的土壤中均能定殖，定殖動(dòng)態(tài)趨勢相似，均為先降低后升高再降低，但定殖速度和定殖數(shù)量差異較大(圖1)。20 ℃、 25 ℃、30 ℃和35 ℃定殖速度與定殖數(shù)量均較高，說明菌株TF28在土壤中有效定殖的溫度范圍較廣，35 ℃定殖速度最快，接種14 d菌數(shù)最高(3.6×107cfu/g)，25 ℃定殖數(shù)量最高，接種21 d菌數(shù)最大(3.8×107cfu/g)，接近初始接種量(4.0×107cfu/g)；低溫15 ℃定殖速度最慢且定殖數(shù)量最低，接種21 d菌數(shù)最大為2.2×107cfu/g。該結(jié)果表明溫度影響菌株TF28在土壤中的定殖速度與定殖數(shù)量， 菌株TF28在20～35 ℃均能在土壤中有效定殖，25 ℃、30 ℃、35 ℃這3個(gè)溫度處理之間差異不顯著，綜合4個(gè)時(shí)期菌株總體定殖數(shù)量，25 ℃更利于菌株定殖。

圖柱上不同小寫字母代表同一處理不同時(shí)期之間差異顯著(P<0.05),下同。

Different lowercase letters indicate significant difference of the same treatmentof the same process(P<0.05), the same as below.

圖1 不同溫度時(shí)菌株TF28在土壤中定殖數(shù)量
Fig.1 Colonization quantity of strain TF28
in soil in different temperature

2.2 含水量對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響

含水量影響菌株TF28在土壤中的定殖，定殖速度隨含水量增加而加快。由圖2可見，35%含水量在接種后14 d定殖數(shù)量最大(3.0×107cfu/g)，另外4個(gè)處理均在接種后21 d定殖數(shù)量最大， 5%、8%、15%和25%含水量的最大定殖數(shù)量分別為2.8×107cfu/g、3.0×107cfu/g、3.8×107cfu/g和 3.1×107cfu/g，15%含水量定殖數(shù)量最高(圖2)。該結(jié)果表明菌株TF28在比較寬泛的土壤濕度范圍內(nèi)均能有效定殖，綜合4個(gè)時(shí)期菌株總體定殖數(shù)量，含水量為15%更利于菌株TF28在土壤中定殖，低于或高于15%定殖數(shù)量降低，但各處理之間差異不顯著。

2.3 pH對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響

pH影響菌株TF28在土壤中的定殖。菌株TF28在pH 4.5～8.6時(shí)能夠在土壤中定殖，但定殖速度和定殖數(shù)量存在差異，在pH 4.5的土壤中定殖能力最低，在微酸性和中性土壤(pH 5.4、6.2、7.0)中定殖能力較強(qiáng)，定殖數(shù)量無顯著差別，接種21 d菌數(shù)均達(dá)到最大值，pH 7.0的菌數(shù)最高，為4.1×107cfu/g；在堿性土壤(pH 7.8和8.6)中定殖能力低于弱酸性與中性土壤，高于pH 4.5的酸性土壤(圖3)。

圖2 不同含水量下菌株TF28在土壤中定殖數(shù)量的變化Fig.2 Changes of soil moisture on colonization quantity of strain TF28 in soil

圖3 不同pH下菌株TF28在土壤中定殖數(shù)量的變化Fig.3 Changes of pH on colonization quantity of strain TF28 in soil

2.4 接菌量對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響

接種量顯著影響菌株TF28在土壤中的定殖，5%接種量定殖速度最慢，定殖數(shù)量最低；15%接種量次之，20%和25%接種量定殖能力相當(dāng)，均在21 d時(shí)定殖數(shù)量最高，分別為3.8×107和4.4×107cfu/g，兩者之間差異不顯著(圖4)。

2.5 土壤類型對(duì)TF28菌株在土壤中定殖的影響

選取同江、集賢和加格達(dá)奇大豆田土壤進(jìn)行試驗(yàn)(圖5)，3個(gè)地區(qū)土壤類型分別為黑鈣土、草甸土和黑土。pH均為弱酸性，分別為5.2、5.4 和5.8。土壤性質(zhì)不同，加格達(dá)奇土壤偏黑，土壤結(jié)構(gòu)好，養(yǎng)分豐富，有機(jī)質(zhì)較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 40.56 g/kg，同江和集賢土壤偏黃，土壤粘重，通氣透水性稍差，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)略低，分別為 35.24 g/kg和32.44 g/kg。菌株TF28在3個(gè)地區(qū)土壤中均能有效定殖，在加格達(dá)奇土壤中定殖能力最強(qiáng)，其次是同江和集賢，三者之間差別不顯著，說明菌株TF28可在不同土壤類型中定殖。

圖4 不同接種量下菌株TF28在土壤中定殖數(shù)量的變化Fig.4 Changes of inoculation amount on colonization quantity of strain TF28 in soil

圖5 不同地區(qū)土壤菌株TF28在土壤中定殖的變化Fig.5 Changes of soil from different areas on colonization quantity of strain TF28 in soil

2.6 病原菌對(duì)菌株TF28在土壤中定殖的影響

病原菌顯著影響菌株TF28在土壤中的定殖。由圖6可見，接種病原菌14 d內(nèi)顯著促進(jìn)菌株TF28在土壤中的定殖，接種7 d，定殖數(shù)量最高，為3.5×107cfu/g，是對(duì)照的2倍，之后逐漸降低，接種28 d菌數(shù)與對(duì)照相比降低1倍。

圖6 病原菌處理下TF28在土壤中數(shù)量的變化Fig.6 Changes of pathogenic fungi on colonization quantity of strain TF28

3 結(jié)論與討論

生防菌的定殖能力是影響其生防效果的重要因素，受自身特性與土壤環(huán)境等因素影響，研究生防菌的定殖能力是評(píng)價(jià)其是否具有應(yīng)用前景的重要指標(biāo)之一[2]。本試驗(yàn)利用大豆田根際自然土壤研究離體條件下溫度、含水量、pH、土壤類型、接種量及病原菌對(duì)解淀粉芽孢桿菌TF28定殖能力的影響(今后尚需進(jìn)行田間定殖試驗(yàn)研究)，以揭示植物、生防菌、土壤微生物環(huán)境三者之間的互作關(guān)系，為菌株的應(yīng)用提供理論和技術(shù)支撐。

土壤溫度、pH及含水量是影響生防菌定殖能力的主要環(huán)境因素，溫度是一個(gè)最重要因素，研究發(fā)現(xiàn)，生防菌Pseudomonasfluorescens和Serratiaplymuthica適于在較低溫度下定殖，其原因是土著微生物低溫時(shí)生物活性降低，與外來生防菌的競爭力下降，利于生防菌的定殖[9,13-15]。王淑芳等[16]研究發(fā)現(xiàn)溫度顯著影響海洋多粘芽孢桿菌L1-9在黃瓜根際土壤中的定殖，較高溫度其定殖速度加快，較低溫度其定殖數(shù)量較大， 25 ℃最適于其定殖。劉慶豐等[17]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌XF1在16～28 ℃能夠在白菜根圍土壤中很好地定殖，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株TF28在低溫 15 ℃條件下定殖能力較低，在20～35 ℃其定殖能力均較強(qiáng)，說明菌株TF28對(duì)溫度的適應(yīng)能力較強(qiáng)，能夠應(yīng)對(duì)復(fù)雜多變的農(nóng)田溫度，提高其應(yīng)用穩(wěn)定性。

土壤酸堿度是另一個(gè)重要因素，土壤pH影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及有效性，pH降低會(huì)減少可溶性有機(jī)質(zhì)，導(dǎo)致土壤碳、氮源減少[6]。研究發(fā)現(xiàn)，土壤酸堿度對(duì)生防菌定殖的影響因菌株而異，生防菌Pseudomonadfluorescens2-79[18]和SerratiaplymuthicaA21-4[9]適于在弱酸性土壤中定殖，海洋多粘芽孢桿菌L1-9在中性土壤中定殖能力最強(qiáng)[19]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株TF28在寬泛的酸堿度范圍(pH 4.5～8.6)內(nèi)都能很好地定殖，弱酸性和中性更利于其定殖。目前，中國農(nóng)田土壤因長期施用氮肥，土壤酸化嚴(yán)重，菌株在TF28在酸性土壤中具有很好的定殖能力，說明該菌株還有效緩解因土壤酸化造成的土壤板結(jié)和地力下降 問題。

土壤濕度對(duì)生防菌的定殖也有一定的影響，較低濕度利于SerratiaplymuthicaA21-4的定殖，其原因是土壤孔隙多，含氧量高利于菌株生長[10]，本研究發(fā)現(xiàn)菌株TF28 在5%～35%土壤濕度范圍內(nèi)均能有效定殖，最適濕度為15%含水量， 說明該菌株在農(nóng)田土壤水分變化較大情況下能夠很好地定殖，更具有應(yīng)用價(jià)值。土壤類型對(duì)菌株TF28定殖也有一定影響，在有機(jī)質(zhì)相對(duì)高的土壤中定殖能力較強(qiáng)，與已有報(bào)道一致[20]。

連作大豆由Fusariumoxysporum引起的根腐病日趨嚴(yán)重，前期研究發(fā)現(xiàn)菌株TF28能夠有效抑制該病菌生長，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種Fusariumoxysporum病菌對(duì)菌株TF28的定殖有促進(jìn)作用，可能是接種病原菌后，激活了生防菌對(duì)病原菌生存位點(diǎn)及營養(yǎng)物質(zhì)的競爭能力，促進(jìn)生防菌在短期內(nèi)快速生長以抵御病原菌入侵。另外，引入土壤中生防菌數(shù)量顯著影響其定殖能力，較高接種量其定殖能力增強(qiáng)，其原因是較高接種量激活其群體感應(yīng)系統(tǒng)，促進(jìn)了生防菌的生長。