張 娟，李 丹，王順喜，夏曉華，段傳人

（1.重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶 400030；2.重慶蜂谷美地生態(tài)養(yǎng)蜂有限公司，重慶 404508）

蜂糧顧名思義為蜜蜂的食物，是幼蜂的主要食物來(lái)源，對(duì)于蜂群的繁衍生息具有重要作用[1]。蜜蜂在蜂巢中將采集到的花粉團(tuán)咬碎后用蜂蠟封藏，封藏的花粉團(tuán)在微生物的作用下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的發(fā)酵便形成了蜂糧[2-3]。蜂糧的保健作用是近年來(lái)才被開(kāi)發(fā)的，蜂糧具有豐富的營(yíng)養(yǎng)并且能夠提高人體抵抗力，目前已經(jīng)成為一種極具開(kāi)發(fā)前景的產(chǎn)品[4-5]。近些年，蜂糧商品在巴西、新加坡等國(guó)家已有上市，但是蜂糧商品在我國(guó)市場(chǎng)幾乎沒(méi)有。

雖然天然蜂糧的產(chǎn)量比較穩(wěn)定，但是由于以下原因無(wú)法像其他蜂產(chǎn)品一樣可以容易地獲?。阂皇且?yàn)樘烊环浼Z被蜜蜂封在蜂房中，人為收集會(huì)破壞蜂房結(jié)構(gòu)，影響蜂群的生活習(xí)性；二是天然蜂糧的產(chǎn)量低，僅僅只是供應(yīng)幼蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)，人為強(qiáng)取會(huì)影響整個(gè)蜂群的繁衍生息；三是天然蜂糧的成分復(fù)雜，且含有蜂卵等不易去除的雜質(zhì)，因而對(duì)生產(chǎn)加工要求高[6-7]。所以要進(jìn)行人工發(fā)酵蜂糧，人工發(fā)酵蜂糧的優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面：一是人工發(fā)酵蜂糧的原料是花粉，來(lái)源不受限制，可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)；二是人工發(fā)酵蜂糧是用純天然花粉進(jìn)行發(fā)酵，不添加任何添加劑，從而保證發(fā)酵產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分貼近于天然蜂糧。本研究對(duì)人工蜂糧的兩種發(fā)酵方式（固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵）的乳酸菌活菌數(shù)以及主要的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了對(duì)比分析，為后續(xù)人工蜂糧大規(guī)模生產(chǎn)提供參考依據(jù)[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：從天然蜂糧中提取出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為發(fā)酵菌株。

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉5g/L，葡萄糖20g/L，吐溫-80 1 mL，酵母粉4 g/L，瓊脂粉15 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，pH 6.2。

硫酸、乙醇、硼酸、蒽酮、氫氧化鈉（分析純）：重慶川東化工廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1BU/18U型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；THZ-C型搖床：北京寅韜興業(yè)科技有限公司；30L-7000c發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備有限公司；日立835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀：日本日立公司；723N 型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光學(xué)儀器一廠(chǎng)；SHZ-D真空泵：上海暉創(chuàng)化學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)內(nèi)挑取1～2環(huán)保藏在斜面上的植物乳桿菌接種于MRS平板上，置于37 ℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。然后挑取2～3環(huán)已經(jīng)活化的菌株到30 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h，制成濃度約為106個(gè)/mL的菌懸液[11]。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵方法

稱(chēng)取50 g花粉倒入錐形瓶?jī)?nèi)，與20%的無(wú)菌水混勻高壓滅菌之后，待溫度降至40 ℃左右加入9%的乳酸菌培養(yǎng)液后置于35 ℃的生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行冷凍真空干燥[9，12]。

1.3.3 液態(tài)發(fā)酵方法

稱(chēng)取花粉500 g經(jīng)研磨、過(guò)篩后，倒入發(fā)酵罐內(nèi)，加入料液比為0.13∶1（g∶mL）的無(wú)菌水充分混勻后高壓滅菌30 min。冷卻后，接入10%的乳酸菌培養(yǎng)液，設(shè)定發(fā)酵罐溫度為33 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為445 r/min，待發(fā)酵罐顯示屏上連續(xù)2 d之內(nèi)的pH變化＜0.02時(shí)停止發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行離心、冷凍真空干燥處理[6，13]。

1.3.4 蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定

稱(chēng)取5.0 g蜂糧倒入三角瓶（裝有適量玻璃珠）中，然后加入15 mL蒸餾水進(jìn)行振蕩，使樣品被研磨成均勻的稀釋液。用梯度稀釋法再次進(jìn)行稀釋?zhuān)♂屘荻确謩e為10-1，10-2，10-3，……10-9，在超凈工作臺(tái)內(nèi)吸取100 μL各個(gè)梯度的樣品到MRS固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后將平板放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d后選擇蜂糧含菌量大概在10個(gè)/cm2的梯度平板為適宜濃度，兩個(gè)平板為一個(gè)濃度，結(jié)果取平均值[14-15]。

1.3.5 蜂糧感官評(píng)定

（1）感官評(píng)定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

感官評(píng)定主要考慮蜂糧產(chǎn)品的顏色、香氣、口感，具體的評(píng)價(jià)方法為：采用標(biāo)準(zhǔn)比色卡對(duì)蜂糧的顏色進(jìn)行對(duì)比之后，在距離鼻子0.5 cm處通過(guò)嗅覺(jué)感受香氣，然后稱(chēng)取5 g蜂糧取食感受蜂糧的口感。每項(xiàng)指標(biāo)滿(mǎn)分5分，請(qǐng)5名專(zhuān)業(yè)的食品評(píng)判員對(duì)這三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行打分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[16]。

表1 蜂糧感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of bee bread

（2）感官評(píng)定指標(biāo)權(quán)重

為了把握單個(gè)指標(biāo)在總評(píng)價(jià)中的相對(duì)水平，請(qǐng)8名從事食品檢測(cè)和評(píng)價(jià)的工作人員對(duì)以上三個(gè)感官評(píng)價(jià)因素進(jìn)行打分，從而確定蜂糧感官評(píng)價(jià)時(shí)各因素的權(quán)重。

1.3.6 蜂糧中總糖含量的測(cè)定

采用蒽酮比色法[17-18]對(duì)蜂糧中的總糖含量進(jìn)行測(cè)定。在試管中加入0.2 g新鮮蜂糧，加入5 mL蒸餾水，振蕩均勻后管口加蓋在沸水浴煮沸10 min，流水冷卻至室溫，過(guò)濾，將濾液配制成25 mL的水溶液。然后取上述溶液0.1 mL，然后加0.9 mL的蒸餾水進(jìn)行稀釋?zhuān)礃?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定的方法，測(cè)定溶液的吸光度值，并重復(fù)操作3次?？偺呛康挠?jì)算公式如下：

1.3.7 總蛋白含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法對(duì)花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵的蜂糧進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[19]。

1.3.8 氨基酸含量的測(cè)定對(duì)花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵的蜂糧進(jìn)行氨基酸含量的測(cè)定[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)的曲線(xiàn)分析

對(duì)固態(tài)及液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中每一天的蜂糧進(jìn)行乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定，連續(xù)測(cè)定8 d，測(cè)定結(jié)果如圖1所示。

圖1 兩種發(fā)酵方式蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)的曲線(xiàn)Fig.1 Curve of viable lactic acid bacteria count in bee bread by two fermentation methods

根據(jù)圖1的曲線(xiàn)可以觀(guān)察到，固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中蜂糧中乳酸菌的活菌數(shù)在發(fā)酵第7天達(dá)到最大值為1.65×107CFU/g，液態(tài)發(fā)酵條件下，蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)在發(fā)酵第3天達(dá)到最大值為2.12×107CFU/g，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于固態(tài)發(fā)酵。這說(shuō)明液態(tài)發(fā)酵條件更有利于乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，因而經(jīng)液態(tài)發(fā)酵的蜂糧中的活菌數(shù)更多。

2.2 兩種發(fā)酵方式發(fā)酵蜂糧的感官評(píng)分

8名工作人員對(duì)蜂糧3個(gè)感官因素的評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 感官評(píng)定的指標(biāo)權(quán)重Table 2 Index weight of sensory evaluation

綜合表1和表2，經(jīng)過(guò)計(jì)算，蜂糧的顏色、香味、口味的權(quán)重系數(shù)分別為0.29、0.27、0.44。設(shè)蜂糧顏色評(píng)分為X，香味評(píng)分為Y，口味評(píng)分為Z，則蜂糧綜合感官評(píng)分公式為：蜂糧綜合感官評(píng)分=0.29X+0.27Y+0.44Z。

請(qǐng)專(zhuān)業(yè)的食品評(píng)判員對(duì)固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵的蜂糧進(jìn)行感官評(píng)分，再根據(jù)綜合計(jì)算公式得到感官評(píng)分，結(jié)果如表3所示。

表3 兩種發(fā)酵方式蜂糧感官評(píng)分對(duì)比Table 3 Comparison of sensory score of bee bread between two fermentation methods

根據(jù)表3的結(jié)果可知，從顏色來(lái)看，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵的蜂糧顏色較液態(tài)發(fā)酵的顏色淺；從香味來(lái)看，液態(tài)發(fā)酵的蜂糧香氣更濃；從口感分析，液態(tài)發(fā)酵的蜂糧的口感更好。綜合分析，相比于固態(tài)發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵的蜂糧的感官評(píng)分更高，得分為4.44分。

2.3 總糖含量

為了研究發(fā)酵對(duì)花粉中總糖含量的影響，對(duì)天然花粉、天然蜂糧、固態(tài)發(fā)酵以及液態(tài)發(fā)酵的人工蜂糧進(jìn)行總糖含量的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表4所示。

表4 花粉、天然蜂糧、固態(tài)發(fā)酵蜂糧以及液態(tài)發(fā)酵蜂糧的總糖含量對(duì)比Table 4 Comparison of total sugar content of pollen,natural bee bread,solid-state and liquid-state fermented bee bread

由表4可知，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后的花粉的總糖含量升高，且人工發(fā)酵的蜂糧中的總糖含量高于天然蜂糧；液態(tài)發(fā)酵的蜂糧中的總糖含量略微高于固態(tài)發(fā)酵。這可能是因?yàn)橐簯B(tài)發(fā)酵更為徹底，使得蜂糧中的可溶性糖含量尤其是果糖含量增多。

2.4 總蛋白含量

為了探究發(fā)酵對(duì)花粉中總蛋白含量的影響，對(duì)花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵的蜂糧進(jìn)行總蛋白含量的測(cè)定，測(cè)定的結(jié)果如表5所示。

表5 花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵蜂糧中總蛋白含量的對(duì)比Table 5 Comparison of total protein content in pollen,natural bee bread,solid-state and liquid-state fermented bee bread

根據(jù)表5的數(shù)據(jù)可以得知，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后的蜂糧總蛋白的含量有輕微上升，并且可以看出液態(tài)發(fā)酵的蜂糧中總蛋白含量略高于固態(tài)發(fā)酵。分析可能是因?yàn)橐簯B(tài)發(fā)酵加入的乳酸菌培養(yǎng)液較多，而培養(yǎng)液中有含氮物質(zhì)，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后轉(zhuǎn)變成了某種有機(jī)氮分子，從而使得總蛋白含量升高。

2.5 氨基酸含量

為了探究發(fā)酵對(duì)花粉中氨基酸含量的影響，對(duì)花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵的蜂糧中氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的結(jié)果如表6所示。

表6 花粉、天然蜂糧、固態(tài)以及液態(tài)發(fā)酵蜂糧中氨基酸含量的對(duì)比Table 6 Comparison of amino acid contents in pollen,natural bee bread,solid-state and liquid-state fermented bee bread g/100 g

根據(jù)表6的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，人工發(fā)酵蜂糧中各種氨基酸含量豐富，尤其是天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量較高，而這些氨基酸對(duì)增強(qiáng)免疫能力有很大幫助。并且可以看出固態(tài)發(fā)酵的蜂糧中氨基酸含量不及液態(tài)發(fā)酵氨基酸含量高。原因可能為乳酸菌培養(yǎng)液中的含氮分子經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成了各種氨基酸。

3 結(jié)論

通過(guò)考察蜂糧發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，對(duì)蜂糧的總糖含量、總蛋白含量以及氨基酸含量進(jìn)行了分析測(cè)定。實(shí)驗(yàn)證明了人工發(fā)酵蜂糧中的總糖、總蛋白含量以及氨基酸含量均優(yōu)于天然蜂糧和花粉；使用同樣的乳酸菌對(duì)同種花粉進(jìn)行發(fā)酵的結(jié)果表明，無(wú)論是蜂糧中總糖含量、總蛋白含量還是氨基酸含量，液態(tài)發(fā)酵的蜂糧的結(jié)果都明顯高于固態(tài)發(fā)酵。這是由于液態(tài)發(fā)酵經(jīng)過(guò)攪拌，乳酸菌與花粉的接觸面積變大，有利于花粉的充分發(fā)酵。從大規(guī)模生產(chǎn)的角度上來(lái)考慮，液態(tài)發(fā)酵乳酸菌繁殖快，能夠提高生產(chǎn)效率；另一方面液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的蜂糧感官評(píng)分以及主要營(yíng)養(yǎng)成分，如總糖、總蛋白以及氨基酸含量都高于固態(tài)發(fā)酵，保證了人工發(fā)酵蜂糧的質(zhì)量。因此用液態(tài)發(fā)酵蜂糧的方式具有更多的優(yōu)勢(shì)，可用此進(jìn)行蜂糧的大規(guī)模生產(chǎn)。