劉 松，趙振宇，江 鋒，聶 葉，王和玉

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷 564501）

中國白酒歷史悠久，它與威士忌、伏特加、白蘭地、朗姆酒、金酒并稱為世界6大蒸餾酒。中國白酒以糧谷為主要原料，以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾而制成[1]。為了保護(hù)我國民族傳統(tǒng)產(chǎn)品，國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定白酒中禁止添加任何添加劑[2]。但為了掩蓋白酒的苦澀，保持酒體干冽、醇厚、綿軟，仍存在不良白酒生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中違法添加甜味劑來改善白酒口感的現(xiàn)象。

甜味劑是一類能賦予食品甜味的食品添加劑，按其來源可分為天然甜味劑和人工合成甜味劑，其中人工合成甜味劑可分為磺胺類、二肽類、蔗糖衍生物等三大類[3]。食品藥品監(jiān)管總局2014年白酒專項(xiàng)監(jiān)督抽查結(jié)果顯示，因添加甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜等甜味劑而被判定為不合格的白酒占3.6%，而不合格產(chǎn)品中甜味劑的檢出限均低于相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)中的檢出限（GB 5009.28—2016《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》[4]、GB 5009.263—2016《食品中阿斯巴甜和阿力甜的測定》[5]、GB/T 5009.140—2003《飲料中乙?；前匪徕浀臏y定》[6]）。在相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)中，測定甜味劑種類單一，檢出限較高，達(dá)不到國外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提出“酒中甜蜜素不得檢出（＜100 μg/L）”的要求[7]。目前食品中甜味劑的檢測主要有高效液相色譜法[8-11]、離子色譜法[12-14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-21]等，高效液相色譜法具有同時檢測甜味劑種類多、靈敏度高等特點(diǎn)成為食品中甜味劑檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢，本研究針對白酒樣品的特性，建立一種同時測定白酒中7種人工甜味劑、9種天然甜味劑的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（ultra high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field-orbitrap-high resolution mass spectrometry，UPLCQ-Orbitrap-HRMS）測定方法，為白酒中多種甜味劑的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9種白酒（L1～L9）：市售濃香型、清香型、醬香型等不同品牌的白酒。

安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、紐甜、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C、杜克甙A、瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷D、甜葉懸鉤子苷、甘草甜、蔗糖共計(jì)16種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：美國Sigma公司；乙腈、甲醇（均為色譜級）：德國默克公司；無水乙醇（色譜級）：美國天地公司；0.22 μm的PTFE微孔濾膜：美國Agilent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XP205分析天平：METTLER TOLEDO公司；IQ7003純水儀：美國MILLIPORE公司、Accela1250型高效液相色譜、Q-Exactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo公司；MIKRO 220R離心機(jī)：德國Hettich公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 儀器條件

色譜條件：Hypersil Gold aQ液相色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.9 μm）；進(jìn)樣量5 μL；流動相：甲醇-水（含5 mmol/L乙酸銨）；流速：300 μL/min；梯度洗脫：洗脫程序見表1；整個分析流程共15 min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采用加熱電噴霧電離源，正負(fù)離子模式同時掃描模式，源參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓為±3.2 kV，鞘氣為40 arb（1 arb≈0.3 L/min），輔助氣為15 arb，吹掃氣為0 arb，霧化溫度為220 ℃，掃描范圍為150～1 200 amu，分辨率為70 000，掃描模式為一級全掃描＋自動觸發(fā)二級，離子傳輸管溫度為350 ℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取16種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)品100.000 mg，用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇水溶液溶解，定容至100.0 mL棕色容量瓶中，振蕩均勻即得質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃冰箱中保存，備用。分別用水逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，得到16種甜味劑質(zhì)量濃度依次為5.0 μg/L、10.0 μg/L、25.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、250.0 μg/L、500.0 μg/L、1 000.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 樣品前處理

準(zhǔn)確吸取1.0 mL的白酒樣品，在40 ℃水浴中氮吹除醇，加水定容至1.0 mL，漩渦混勻，4 ℃、12 000 r/min條件下離心，過0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的優(yōu)化

分別嘗試了ZORBAXXDB-C18（2.1mm×100mm，1.8μm）、ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）和Hypersil Gold aQ（2.1 mm×150 mm，1.9 μm）三種色譜柱對分離效果的影響，結(jié)果顯示，甜菊苷和瑞鮑迪苷B為同分異構(gòu)體，使用XDB-C18色譜柱無法實(shí)現(xiàn)這兩種化合物的分離。故只列舉SB-C18以及Hypersil Gold aQ色譜柱對化合物分離的結(jié)果，分別見圖1和圖2。

圖1 采用SB-C18色譜柱部分化合物離子提取色譜圖Fig.1 Partial compound ion extraction chromatogram using SB-C18column

圖2 采用Hypersil Gold aQ色譜柱16種甜味劑離子提取色譜圖Fig.2 Ion extraction chromatogram of 16 sweeteners using Hypersil Gold aQ column

結(jié)果表明，SB-C18色譜柱可以使16種化合物基線完全分離，但安賽蜜、紐甜、甜菊苷、瑞鮑迪苷B、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C、杜克甙A、甜葉懸鉤子苷、瑞鮑迪苷D等出現(xiàn)峰分叉問題（圖1），進(jìn)一步考察了乙腈-水（含10 mmol/L乙酸銨）、乙腈-水（含5 mmol/L乙酸銨）、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水（含5 mmol/L乙酸銨）等流動相對峰型的影響，結(jié)果顯示，上述流動相均無法解決峰分叉的問題。由圖2可看出，Hypersil Gold aQ柱可以使16種化合物達(dá)到分析的要求，16種化合物基線完全分離，峰型對稱。從不同流動相梯度洗脫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，甲醇-水（含5 mmol/L乙酸銨）和乙腈-水（含5 mmol/L乙酸銨）均能滿足16種化合物的洗脫要求，且靈敏度無明顯差異，與范廣宇[21]等結(jié)論不同，從環(huán)保和經(jīng)濟(jì)成本考慮，本文選擇甲醇-水（含5 mmol/L乙酸銨）為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

2.2 儀器條件優(yōu)化

比較了正離子和負(fù)離子模式下各物質(zhì)的響應(yīng)值，結(jié)果見表2。由表2可知，阿斯巴甜在正離子模式下響應(yīng)值優(yōu)于負(fù)離子模式，其他15種化合物在負(fù)離子模式下響應(yīng)值優(yōu)于正離子模式，為滿足所有化合物的最佳測定需求，本研究選擇了正負(fù)離子同時掃描的模式，優(yōu)化條件后16種化合物的電離模式、精確質(zhì)量數(shù)等信息見表2。

表2 16種甜味劑的精確質(zhì)量數(shù)、電離模式、保留時間、定性離子等參數(shù)Table 2 Accurate mass,ionization mode,retention time,qualitative ions of 16 sweeteners

2.3 樣品前處理

分別開展了酒樣稀釋5倍、稀釋10倍和氮吹除醇3種前處理方式實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，酒樣稀釋5倍，基質(zhì)效應(yīng)比較嚴(yán)重，部分化合物低濃度加標(biāo)回收率＜50%，高濃度加標(biāo)水平加標(biāo)回收率＞150%；而樣品稀釋10倍，醬香型白酒存在低濃度加標(biāo)回收率偏低，高濃度加標(biāo)回收率偏高問題。進(jìn)一步加大稀釋倍數(shù)，可以解決酒樣基質(zhì)效應(yīng)問題，但因方法的定量限較高，不符合實(shí)際樣品的檢測，因此稀釋方法不適合所有白酒中痕量甜味劑的檢測。

試驗(yàn)進(jìn)一步采用氮吹結(jié)合高速冷凍離心處理的方式，白酒樣品在40 ℃水浴條件下氮吹，去除白酒中部分易揮發(fā)性物質(zhì)和乙醇，高速冷凍離心去除其他干擾物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16種甜味劑的回收率、精密度和樣品定量限均可滿足檢測需求。所以試驗(yàn)中樣品的前處理選擇40 ℃水浴條件下氮吹，4 ℃、12 000 r/min條件下冷凍離心10 min處理。

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限

在優(yōu)化條件下，配制了16種化合物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2），根據(jù)3倍信噪比確定方法檢出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比確定方法的定量限（limit of quantity，LOQ），結(jié)果見表3。可以看出，16種化合物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.995。三氯蔗糖、蔗糖較同種類型甜味劑的定量限高，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素等甜味劑定量限低，但其線性范圍較窄。

表3 16種甜味劑的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 3 Linearity range,regression equation,related coefficient,and quantitation limits of 16 sweeteners

2.4.2 精密度與回收率

選取空白酒樣進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，由于天然甜味劑與人工甜味劑的定量限存在數(shù)量級差異[21]，因此人工合成甜味劑的加標(biāo)質(zhì)量濃度為20 μg/L、50 μg/L、200 μg/L 3個水平，天然甜味劑加標(biāo)濃度為100μg/L、200μg/L、500μg/L 3個水平，樣品經(jīng)過上述1.3.3節(jié)所述方法處理后，每個水平重復(fù)6次，得到方法的回收率和精密度，結(jié)果見表4。由表4可知，3個添加水平下7種人工甜味劑、9種天然甜味劑的平均回收率為75.8%～119.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.1%～12.0%（n=6），表明精密度和準(zhǔn)確度較好。

表4 16種甜味劑的回收率和精密度（n=6）Table 4 Recovery rates and precisions of 16 sweeteners (n=6)

續(xù)表

2.5 實(shí)際樣品測定

將本方法應(yīng)用于市售的9款白酒（L1～L9）中多種甜味劑的檢測，結(jié)果見表5。由表5可知，3款白酒有蔗糖檢出，只有1款白酒有甜菊苷檢出。

表5 市售9款白酒中16種甜味劑的檢測結(jié)果Table 5 Determination results of 16 sweeteners from 9 kinds of commercial Baijiu μg/L

3 結(jié)論

本研究建立了快速檢測白酒中7種人工甜味劑和9中天然甜味劑的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法。白酒樣品經(jīng)過加熱氮吹除醇、水定容后冷凍離心，15 min內(nèi)完全分離，在3個不同加標(biāo)水平下，回收率在75.8%～119.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～12.0%（n=6），定量限0.2～25.5 μg/L。同時對市售的不同香型酒進(jìn)行檢查，結(jié)果表明，該檢測方法快速、簡單、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于白酒中16種痕量甜味劑的定性、定量檢測。