毛彥穩(wěn) 張小歡 劉慧銘 王圓圓 湯磊 郭兵

貴州醫(yī)科大學(xué)1病理生理學(xué)教研室，2重大疾病發(fā)病機(jī)制及藥物防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3醫(yī)藥衛(wèi)生管理學(xué)院（貴陽(yáng)550025）

研究表明，由持續(xù)高血糖狀態(tài)和晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）的增加引起的氧化應(yīng)激是糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）早期發(fā)病機(jī)制之一［1-5］。在DN 病理進(jìn)程中，氧化應(yīng)激的發(fā)生造成腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜細(xì)胞及系膜細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，蛋白尿增多，最終使得腎功能受損［6-7］。硫辛酰胺（dl-alphalipoamide，ALM）對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用更多的是作為一種間接抗氧化劑，同時(shí)刺激線粒體生物合成和誘導(dǎo)Ⅱ期抗氧化酶，且對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變也有防治作用［8］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［9-11］，高糖（high glucose，HG）條件下，核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SonN（ski-related novel protein N，SnoN）具有抑制細(xì)胞外基質(zhì)（extra-cellular matrix，ECM）的沉積和腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）發(fā)生的作用［12-13］，表明SnoN 蛋白在延緩腎小管上皮纖維化進(jìn)程中扮演重要角色。另有研究發(fā)現(xiàn)，活化的TAK1 可通過(guò)磷酸化SnoN 從而促進(jìn)其泛素化并降解，降低SnoN 蛋白的穩(wěn)定性［14］，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶TAK1［transforming growth factor-β（TGF-β）-activated protein kinase 1，TAK1］活化后還可調(diào)節(jié)ECM的發(fā)生［15］。因此，本研究旨在探究ALM 降低高糖時(shí)腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用是否通過(guò)介導(dǎo)TAK1 及SnoN 蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，為臨床延緩DN 的病程提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑硫辛酰胺（上海生工，中國(guó)），DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone 公司，美國(guó)），TAK1，p-TAK1（Thr184/187）（CST 公司，美國(guó)），SnoN（Santa Cruz 公司，美國(guó)），CollagenⅢ，Desmin（Sigma 公司，美國(guó)），β-actin 單克隆抗體（博士德公司，美國(guó)），胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)），一抗稀釋液，TritonX-100，BCA（bicinchoninic acid）蛋白濃度測(cè)定試劑盒，ECL 顯色劑（北京碧云天生物研究所），F(xiàn)ITC-anti-α-SMA（abcam公司，美國(guó)），PE-anti-E-cadherin（BD 公司，美國(guó)），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）檢測(cè)試劑盒（南京建成公司，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組細(xì)胞隨機(jī)分為：（1）正常糖（NG）組：2% FBS+DMEM+5.5 mmol∕L Glucose；（2）高糖（HG）組：2%FBS+DMEM+25 mmol∕L Glucose；（3）高糖+硫辛酰胺組（HG+ALM）：2% FBS+DMEM+25 mmol∕L Glucose+ALM（200 μmol∕L），分別處理至6 孔板、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶中，48 h 后收取細(xì)胞蛋白，供各檢測(cè)指標(biāo)的進(jìn)行（包括Western Blot 及氧化應(yīng)激）。

1.2.2 細(xì)胞免疫熒光細(xì)胞接種至鋪有蓋玻片的6 孔板中，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好，融合度達(dá)到70%的NRK-52E 細(xì)胞加入細(xì)胞靜止液，置（37 ℃，5%CO2）培養(yǎng)箱16 h，使細(xì)胞同步化生長(zhǎng)，PBS 37 ℃漂洗細(xì)胞3 次，5 min∕次，預(yù)冷細(xì)胞固定液固定20 min，PBS 37 ℃漂洗細(xì)胞3 次，5 min∕次，吸取多余封閉液，加入用細(xì)胞免疫熒光一抗稀釋液分別配置的特異性一抗E-cadherin（1∶200），平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（1∶100），4 ℃慢搖孵育過(guò)夜。室溫下復(fù)溫10 min，細(xì)胞漂洗液37 ℃漂洗細(xì)胞3 次，5 min∕次。按免疫熒光試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，把熒光標(biāo)記二抗按1∶1 000 比例用試劑盒提供二抗稀釋液進(jìn)行稀釋E-cadherin 孵育抗兔FITC，α-SMA 孵育抗小鼠Cy3，37 ℃避光孵育1 h，細(xì)胞漂洗液37 ℃避光漂洗細(xì)胞3 次，5 min∕次。DAPI 按說(shuō)明書(shū)稀釋后室溫避光孵育10 min，細(xì)胞漂洗液37 ℃避光漂洗細(xì)胞3 次，每次5 min。用試劑盒提供的抗熒光淬滅封片液滴至載玻片上，蓋上載玻片。OLYMPUS-DP72 倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.3 Western Blot 檢測(cè)提取細(xì)胞蛋白，加入蛋白裂解液后離心、取上清用，BCA 試劑盒（碧云天）測(cè)定各組蛋白質(zhì)濃度，按所測(cè)得濃度計(jì)算每泳道所需體積，加入加樣緩沖液煮沸10 min。經(jīng)10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入SnoN 及TAK1、p-TAK1（Thr184/187）、E-cadherin、α-SMA、Desmin、β-actin一抗，工作濃度分別為1∶800、1：600、1∶800、1∶800、1∶800、1∶800、和1∶1 000，4 ℃孵育過(guò)夜。次日用TBST 洗膜后，加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的2 抗（濃度均為1∶6 000）室溫孵育1 h，再加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，曝光，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片，軟件分析各條帶的面積和灰度值，兩者乘積為積分灰度值，每個(gè)樣本重復(fù)操作3 次。一張膠上SnoN 及TAK1、p-TAK1（Thr184/187）、Ecadherin、α-SMA、Desmin 與相應(yīng)的β-actin 條帶所測(cè)積分灰度值的比值，即相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 氧化應(yīng)激氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)丙二醛（malonaldehyde，MDA）及抗氧化應(yīng)激指標(biāo)總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）檢測(cè)胰酶消化細(xì)胞，10% FBS 培養(yǎng)基終止消化，12 000 r∕min離心15 min，棄上清。按說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)試劑，并在酶標(biāo)儀上測(cè)各管的吸光度值并計(jì)算濃度。

1.2.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，待其密度在1×106∕mL，胰酶消化細(xì)胞至于離心管中，用預(yù)冷的PBS 洗3 次，并加入適量PBS 重懸細(xì)胞，置于EP管中，將重懸好的細(xì)胞隨機(jī)分組：對(duì)照組、PE 單染組、FITC 單染組、實(shí)驗(yàn)組（雙染），向相應(yīng)組別中加入0.1 ～10 μg∕mL的PE或者PITC標(biāo)記的抗體，輕輕混勻，室溫或者4 ℃避光孵育30 min，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞，400×g離心5 min，重復(fù)3 次，棄上清，加入500 μL 預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，按照順序：對(duì)照組、PE單染組、FITC單染組、實(shí)驗(yàn)組（雙染）依次設(shè)門，進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果以百分?jǐn)?shù)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0 軟件，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E 細(xì)胞株）表型鑒定細(xì)胞免疫熒光結(jié)果：NG 組NRK-52E 細(xì)胞胞漿中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 蛋白陽(yáng)性染色較多，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA 蛋白的陽(yáng)性染色較少；而HG 組E-cadherin 蛋白陽(yáng)性染色減少，α-SMA 蛋白陽(yáng)性染色增多，提示所培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮來(lái)源細(xì)胞，其表型及生物學(xué)特性良好，高糖刺激之后細(xì)胞發(fā)生了EMT（圖1）。

免疫印跡結(jié)果：培養(yǎng)NRK-52E 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與NG 組比較，HG 組中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)減少，而Desmin 蛋白（間充質(zhì)細(xì)胞另一標(biāo)志物）表達(dá)增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05，圖2），并與免疫熒光結(jié)果一致。

2.2 氧化應(yīng)激水平的檢測(cè)與NG 組相比，HG 組的氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)MDA 的含量升高，抗氧化應(yīng)激指標(biāo)T-SOD 的含量降低；與HG 組相比，HG+ALM 組MDA 含量減少，T-SOD 含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05，表1）。

2.3 各組NRK-52E 細(xì)胞中p-TAK1（Thr184/187）、TAK1 和SnoN 蛋白的表達(dá)情況與NG 組相比，HG 組p-TAK1（Thr184/187）、TAK1 蛋白水平表達(dá)增加而SnoN 的表達(dá)降低；與HG 組相比，HG+ALM（200 μmol∕L）組p-TAK1（Thr184/187）、TAK1蛋白水平表達(dá)減少而SnoN 的表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖2 Western Blot 顯示各組NRK52E 細(xì)胞中E-cadherin 及Desmin 蛋白的表達(dá)Fig.2 The expressions of protein E-cadherin and Desmin in NRK-52E cells showed by Western Blot

表1 氧化應(yīng)激顯示各組氧化應(yīng)激水平的比較Tab.1 The comparison of oxidative stress levels in each group ±s

表1 氧化應(yīng)激顯示各組氧化應(yīng)激水平的比較Tab.1 The comparison of oxidative stress levels in each group ±s

注：與NG 組比較，*P ＜0.05；與HG 組比較，#P ＜0.05

分組NG 組HG 組HG+ALM 組T-SOD（U∕mgprot）119.69±27.82 39.15±11.94*66.89±8.19#MDA（nmol∕mgprot）4.86±1.04 23.86±1.84*11.16±0.73#

2.4 各組NRK-52E 細(xì)胞中EMT 和ECM 蛋白指標(biāo)的表達(dá)情況流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：采用FITC標(biāo)記的α-SMA 抗體和PE 標(biāo)記的E-cadherin 抗體，分別檢測(cè)了NG 組、HG 組以及HG+ALM 組中熒光變化。與NG 組相比，HG 組中FITC 熒光值增加，PE 熒光值減少，即細(xì)胞中α-SMA 表達(dá)上調(diào)，E-cadherin 表達(dá)下調(diào)；而與HG 組相比，HG+ALM 組FITC熒光值減少，PE 熒光值增加，即α-SMA 表達(dá)下調(diào)，E-cadherin 表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖3 Western Blot 顯示各組NRK52E 細(xì)胞中p-TAK1（Thr184/187）、TAK1、SnoN 蛋白的表達(dá)Fig.3 The expressions of protein p-TAK1（Thr184/187），TAK1，SnoN in NRK-52E cells of each groups showed by Western Blot

2.5 Western Blot 結(jié)果與NG 組相比，HG 組CollagenⅢ蛋白水平表達(dá)增加而E-cadherin 的蛋白水平表達(dá)降低；與HG 組相比，HG+ALM 組CollagenⅢ蛋白水平表達(dá)減少，而E-cadherin 的蛋白水平表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

3 討論

圖5 Western Blot 顯示各組NRK-52E 細(xì)胞中CollagenⅢ、E-cadherin 蛋白的表達(dá)Fig.5 The expressions of proteinCollagenШ，E-cadherin in NRK-52E cells of each groups

高血糖時(shí)，糖基化終末產(chǎn)物異常增多，抗氧化酶活性及清除自由基能力降低，抗氧化系統(tǒng)防御能力下降，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)度是促進(jìn)腎纖維化發(fā)生EMT 和誘導(dǎo)ECM 沉積的主要環(huán)節(jié)之一［16］。TGF-β1 是促進(jìn)腎臟纖維化發(fā)生的主要因子之一［17］，TAK1 是TGF-β1 的下游因子，經(jīng)TGF-β1 刺激后發(fā)生活化，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)［18］，TAK1 可促進(jìn)ECM 沉積，表明其在器官纖維化的進(jìn)程中亦扮演重要色。SnoN 通過(guò)負(fù)性調(diào)控TGF-β1∕Smads 信號(hào)通路，抑制TGF-β1 致腎臟纖維化生物學(xué)效應(yīng)，延緩腎纖維化的發(fā)生發(fā)展，達(dá)到保護(hù)腎臟的作用［19］。在腫瘤細(xì)胞中有研究發(fā)現(xiàn)［15］，受TGF-β1 活化的TAK1 使得SnoN 發(fā)生多位點(diǎn)磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)SnoN 發(fā)生泛素化水平修飾以降低SnoN 蛋白水平。ALM 具有抗氧化性能夠清除氧自由基，研究發(fā)現(xiàn)［20］，ALM 能夠抑制EMT 的發(fā)生，并呈劑量依賴性，本課題組前期研究表明［21］，對(duì)糖尿病腎病大鼠給予ALM 干預(yù)后，能夠減輕腎臟組織的氧化應(yīng)激損傷，改善腎臟病變。在腎纖維化的進(jìn)程中，TAK1 對(duì)SnoN 蛋白的這種穩(wěn)定性調(diào)節(jié)是否存在，及ALM 是否是通過(guò)影響TAK1∕SnoN 軸，抑制EMT 的發(fā)生，并減輕氧化應(yīng)激損傷，不甚清楚。因此，本研究以體外高糖培養(yǎng)的NRK-52E 細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)ALM 對(duì)高糖時(shí)腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及纖維化的效應(yīng)。

本結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下，腎小管上皮細(xì)胞中的氧化應(yīng)激指標(biāo)水平增加，TAK1、p-TAK1（Thr184/187）及CollagenⅢ的表達(dá)增多，SnoN 與E-cadherin表達(dá)水平下降。給予ALM 干預(yù)后，氧化應(yīng)激的水平降低，TAK1、p-TAK1（Thr184/187）及CollagenⅢ的表達(dá)下降，SnoN 蛋白表達(dá)增多。表明，高糖條件下，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生了氧化應(yīng)激損傷，并伴有TAK1 的活化及高表達(dá)，SnoN 蛋白表達(dá)下降，膠原蛋白的沉積。ALM 干預(yù)后減輕了腎小管氧化應(yīng)激損傷，下調(diào)了TAK1 的表達(dá)，上調(diào)了SnoN 蛋白的表達(dá)，并減少了膠原蛋白的表達(dá)。此結(jié)果與本課題組前期體內(nèi)研究結(jié)果是一致的。如前所述，在腫瘤細(xì)胞研究中，TAK1 通過(guò)介導(dǎo)SnoN 的磷酸化進(jìn)而促進(jìn)SnoN 發(fā)生泛素化修飾，以調(diào)節(jié)SnoN 蛋白的穩(wěn)定性。結(jié)合本研究及本課題組前期的發(fā)現(xiàn)，提示，高糖時(shí)，活化的TAK1 使SnoN 蛋白磷酸化，從而被泛素化降解，最終使SnoN 蛋白水平減少，促進(jìn)腎纖維化病變。ALM 不僅減輕了高糖時(shí)細(xì)胞發(fā)生的氧化應(yīng)激損傷，并通過(guò)影響TAK1∕SnoN 軸，恢復(fù)SnoN 蛋白水平，從而抑制EMT 的發(fā)生及ECM 的沉積，延緩了高糖誘導(dǎo)的腎纖維化進(jìn)程。但是，TAK1 介導(dǎo)SnoN 發(fā)生磷酸化的具體位點(diǎn)及促進(jìn)SnoN 發(fā)生泛素化水平修飾的機(jī)制，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

綜上所述，抗氧化藥物ALM 可能通過(guò)增加腎小管上皮細(xì)胞的抗氧化能力，減弱TAK1 對(duì)SnoN蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)作用，上調(diào)SnoN 蛋白水平，從而抑制高糖環(huán)境下腎纖維化的發(fā)生發(fā)展，因此，深入探討ALM 在DN 中的作用，這為臨床防控及治療DN提供了新的藥物理論基礎(chǔ)。