耿夢華 ，陳 晟 ，吳 敬 ，吳 丹 *

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學，江蘇 無錫 214122；3.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

異麥芽酮糖（isomaltulose），又名帕拉金糖，是蔗糖的同分異構體[1-3]。與蔗糖相比，異麥芽酮糖熱量低、甜度低、不致齲齒[4]。人體食用異麥芽酮糖后，會在血液中以較緩慢的速度代謝為果糖和葡萄糖，不影響體內胰島素的分泌，特別適合于糖尿病人及肥胖人群食用[5]。因此，現在越來越多的人開始關注和食用異麥芽酮糖。

異麥芽酮糖的生產方法主要有生物轉化法和化學轉化法。由于化學轉化法的高能耗、高污染等問題，目前國內外生產異麥芽酮糖普遍采用基于生物催化的蔗糖異構化法[6-12]，即利用微生物合成的蔗糖異構酶（EC 5.4.99.11，sucrose isomerase，SIase）以蔗糖為底物酶轉化生產異麥芽酮糖，催化作用反應式如圖1。生物轉化法主要有細胞轉化法和酶轉化法兩種。細胞轉化法是直接發(fā)酵菌體或將菌體固定化來轉化蔗糖。生產強度低、菌體濃度低及易污染雜菌等問題是在利用細胞轉化法生產異麥芽酮糖時無法避免的，而酶轉化法一般不存在上述問題，所以目前一般是將蔗糖異構酶從微生物細胞中提取出來，再通過游離酶或固定化酶將蔗糖轉化為異麥芽酮糖。相比于游離酶，固定化酶由于其良好的操作穩(wěn)定性及存儲穩(wěn)定性、產物易分離等優(yōu)點而使酶的工業(yè)化應用更加經濟。

目前關于蔗糖異構酶固定化的報道較少。國外僅見FABIANO等[13]以硅藻土吸附法與微膠囊包埋法兩種方法對Erwinia sp.來源的蔗糖異構酶進行固定化，然而這兩種方法所制得的固定化酶酶活力回收率及操作穩(wěn)定性都較差；國內僅見南京工業(yè)大學的WU等[14]以ε-poly-L-lysine修飾過的介孔TiO2為載體對蔗糖異構酶進行固定化，所得固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性與酶活力回收率，且材料較為新穎，但是考慮到成本問題，此方法并不能用于大規(guī)模的工業(yè)化生產。因此，尋求一種成本經濟、操作簡單、酶活力回收率高且操作穩(wěn)定性良好的蔗糖異構酶的固定化方法仍然是目前亟待解決的問題。

圖1 蔗糖異構酶生物催化蔗糖反應式Fig.1 Reaction of sucrose isomerase biocatalysis sucrose

殼聚糖是天然的堿性多糖，吸附性強，常用于酶的固定化[15-16]。本研究擬以殼聚糖微球為載體、戊二醛為交聯劑，對重組工程菌來源的蔗糖異構酶進行固定化，考察各種固定化條件對酶活回收率的影響，并對固定化酶的最佳轉化條件及固定化酶重復使用穩(wěn)定性進行探討，以期為提高蔗糖異構酶的利用效率、降低異麥芽酮糖的生產成本提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

菌種：短小芽孢桿菌（B.brevis/pSVEB-palILSP）由本實驗室保藏。

試劑：牛肉蛋白胨（CP）購自杭州木木生物科技有限公司，大豆蛋白胨（CP）購自上海國藥集團化學試劑有限公司，殼聚糖（脫乙酰度＞90%，CP）購自上海國藥集團化學試劑有限公司，戊二醛（CP）購自阿拉丁公司，異麥芽酮糖、海藻酮糖（GR）購自Sigma公司，其他試劑均為國產AR級。

儀器：AR 2140型電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，冷凍立式離心機購自日本Hitachi公司，Agilent 1200高效液相色譜購自美國Agilent公司，小型高速離心機購自德國Eppendorf公司，UV-1100紫外可見分光光度計購自日本Shimadzu公司，空氣恒溫搖床購自上海精密儀器儀表有限公司，HZ-9212 SB水浴恒溫振蕩器購自太倉市華利達實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蔗糖異構酶游離酶的制備 將藏于本實驗室-80℃冰箱的短小芽孢桿菌甘油管以體積分數2‰的接種量接種于含有30 μg/mL新霉素的10 mL的 TM 培養(yǎng)基中，于200 r/min、30℃培養(yǎng) 8～10 h，制得種子液。按體積分數1%的接種量將種子液轉接入含有30μg/mL新霉素的50 mL的TM培養(yǎng)基，30℃，200 r/min培養(yǎng)48 h后，將發(fā)酵液在12000 r/min、4℃下離心10 min，上清液即為SIase粗酶液。

1.2.2 蔗糖異構酶固定化方法的優(yōu)化 殼聚糖載體的制備：將一定質量的殼聚糖溶解于體積分數2.0%的醋酸溶液中，待形成均一透明的膠體后用注射器將其滴加到4 mol/L的氫氧化鈉溶液中（滴加時注意針頭與液面的距離并保持垂直），形成直徑為2.0 mm左右的微球，后用蒸餾水洗至中性。將制好的殼聚糖微球加入到一定濃度的戊二醛溶液中，4℃放置2 h后用蒸餾水洗去多余的戊二醛，將殼聚糖小球4℃條件下保存于蒸餾水中備用。

蔗糖異構酶的固定化：稱取5.0 g濕殼聚糖微球，加入10 mL含一定單位酶活的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0），于 4 ℃振蕩吸附交聯一定時間后取出抽濾，用蒸餾水洗去未交聯游離酶，即得到固定化酶。

采用單因素實驗分別研究殼聚糖質量濃度（2、3、4、5 g/dL）、戊二醛加量（體積分數）（0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、2.0%、3.0%）、酶加量（30、50、70、100、200 U/g）和固定化時間（4、6、12、16、20、24 h）對固定化效果的影響。

1.2.3 酶活力測定 將900 μL含有蔗糖的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0）加入到1.5 mL的EP管中，加入100 μL適當稀釋的酶液，使得蔗糖的終質量濃度為100 g/L。將混合液振蕩混勻，置30℃的水浴中反應15 min，高溫滅酶，離心取上清。利用HPLC檢測反應樣品中異麥芽酮糖的含量。

酶活力單位定義：上述反應條件下，每分鐘釋放1 μmol異麥芽酮糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

固定化酶活力的測定只需要將100 μL適當稀釋的酶用一定質量的固定化酶代替，其他步驟相同。固定化酶活收率計算公式如下：

式（1）中，R為固定化酶活回收率；K0為加入游離酶總活力；K1為固定化酶總活力。

1.2.4 固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖工藝優(yōu)化

1）溫度對固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的影響。用pH 6.0的磷酸緩沖液溶解400 g/L的蔗糖作為底物，固定化酶加量為20 U/g，反應初始pH 6.0， 分別置于 20、25、30、35、40、45、50 ℃水浴恒溫振蕩器中，150 r/min，轉化12 h。HPLC檢測，計算產物得率。

2）pH值對固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的影響。分別用 pH 值為 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的磷酸緩沖液配制400 g/L的蔗糖作為底物，固定化酶加量為20 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒溫振蕩器，轉化12 h。HPLC檢測，計算產物得率。

3）加酶量對固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的影響。以pH 4.5的400 g/L的蔗糖作為底物，固定化酶加量分別為 5、10、15、20、25 U/g 和 30 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒溫振蕩器中，轉化12 h。HPLC檢測，計算產物得率。

4）底物質量濃度對固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的影響。分別配制pH 4.5的 200、300、400、500、600、700 g/L 和 800 g/L 的蔗糖溶液，固定化酶加量為15 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒溫振蕩器中，轉化12 h。HPLC檢測，計算產物得率。

5）反應時間對固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的影響。以pH 4.5的400 g/L的蔗糖作為底物，加酶量為15 U/g，置于30℃、轉速為150 r/min的水浴恒溫振蕩器中，每隔一定時間取樣500 μL。HPLC檢測，計算產物得率。

1.2.5 HPLC檢測法計算異麥芽酮糖產物得率 轉化后的樣品滅酶后離心，取上清適當稀釋，過濾后備用。HPLC檢測條件參考程勝等[17-18]的方法：流動相為體積分數80%的乙腈，超聲脫氣20 min，流速為0.8 mL/min；柱溫 30℃。

式（2）中，I為異麥芽酮糖產物得率；A1為樣品峰面積；C為標樣濃度；V為樣品體積；k為樣品稀釋倍數；A0為標樣峰面積；m為底物蔗糖質量。

1.2.6 固定化酶的操作穩(wěn)定性研究 以pH 4.5的600 g/L的蔗糖溶液為底物，固定化酶加量為15 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒溫振蕩器中，轉化10 h后將反應液移出，用磷酸緩沖液（pH 4.5）淋洗固定化酶至檢測不出糖，加入底物進行新一批的反應，連續(xù)轉化16批。用HPLC檢測每批異麥芽酮糖生成量，計算各批次產物得率及固定化酶的殘余酶活，考察固定化酶的重復使用穩(wěn)定性。

2 結果與討論

2.1 蔗糖異構酶游離酶的制備

SDS-PAGE電泳如圖2，在大約65×103處即為目的蛋白條帶。

圖2 蔗糖異構酶SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the sucrose isomerase

2.2 蔗糖異構酶固定化方法的優(yōu)化

2.2.1 殼聚糖質量濃度對固定化酶活回收率的影響 在戊二醛加量為1%、加酶量為50 U/g、固定化時間為12 h的條件下研究不同殼聚糖濃度對固定化蔗糖異構酶酶活回收率的影響，結果見圖3。

由圖3可知，于3 g/dL的殼聚糖質量濃度下酶活力回收率達到最大值為53.8%。在實驗過程中發(fā)現，殼聚糖濃度大小會影響溶液的密度和黏度，當殼聚糖質量濃度為1 g/dL時，制得的殼聚糖溶液黏度低。隨著殼聚糖質量濃度的增加，酶活力和酶活力回收率均達到較好的效果。殼聚糖的質量濃度繼續(xù)增大則濃度過高，粘結成塊，這一現象與湯衛(wèi)華等[19]的研究結果一致。因此選擇殼聚糖的質量濃度為3 g/dL。

圖3 殼聚糖質量濃度對固定化蔗糖異構酶活力回收率的影響Fig.3 Effect of chitosan conversation on recovery of immobilized enzyme

2.2.2 戊二醛加量對固定化酶活回收率的影響在殼聚糖質量濃度為3.0 g/dL、加酶量為50 U/g、固定化時間為12 h的條件下研究戊二醛加量對固定化蔗糖異構酶酶活回收率的影響，結果見圖4。

圖4 戊二醛加量對固定化蔗糖異構酶活力回收率的影響Fig.4 Effect of glutaraldehyde concentration on recovery of immobilized enzyme

由圖4可知，酶活力回收率與戊二醛含量呈倒U型關系。戊二醛不僅是固定化酶反應的交聯劑，同時可使酶變性。戊二醛加量增多，殼聚糖微球內的游離醛基數則隨之增多，但過量的戊二醛基會導致酶失活。當戊二醛加量為0.75%時，酶活回收率達到最大值55.6%。因此，選擇固定化酶的最適戊二醛加量為0.75%。

2.2.3 游離酶加量對固定化酶活回收率的影響 在殼聚糖質量濃度為3.0 g/dL、戊二醛加量為0.75%、固定化時間為12 h的條件下研究不同酶加量對固定化蔗糖異構酶酶活回收率的影響，結果見圖5。

圖5 游離酶加量對固定化蔗糖異構酶活力回收率的影響Fig.5 Effect of free enzyme concentration on activity and recovery of immobilized enzyme

由圖5可以看出，當加酶量為50 U/g時，酶活達到最大為27.6 U/g，繼續(xù)加大酶加量則固定化酶的活力增加不顯著。這可能和載體與酶的固定化作用方式有關。在酶加量與固定化上的游離醛基數量未達到平衡時，固定化酶的酶活隨給酶量的增加而增大，但當載體上的醛基與酶作用達到飽和之后繼續(xù)加大酶加量，酶活不會再增加，相應的酶活力回收率逐漸降低。綜合考慮酶制劑的成本、酶活和酶活力回收率，選擇加酶量為50 U/g。

2.2.4 固定化時間對固定化酶活回收率的影響在殼聚糖質量濃度為3.0 g/dL、戊二醛加量為0.75%、加酶量為50 U/g的條件下，研究固定化時間對固定化蔗糖異構酶酶活力回收率的影響，結果見圖6。

圖6 固定化時間對固定化蔗糖異構酶活力回收率的影響Fig.6 Effect of immobilization time on activity and recovery of immobilized enzyme

由圖6可以看出，當固定化時間達到16 h后，載體與酶的作用達到飽和，此時酶活力回收率達到70.3%，酶活為 35.2 U/g，酶固載量為 0.04 mg/g，因此選擇的固定化時間是16 h。

2.3 固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖工藝優(yōu)化

2.3.1 溫度對固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的影響 如圖7所示，30℃時，異麥芽酮糖產物得率達到最大值83.4%。溫度升高或降低，產物得率均呈下降趨勢。這與蔗糖異構酶同時具有水解與異構活性有關。實驗過程中發(fā)現，高溫可能有利于蔗糖的水解反應，酶轉化體系中單糖含量會隨著溫度的升高而增加。而低溫雖然有利于異構化，但此時酶的構象更利于生成海藻酮糖。這與ZHANG等[20]研究Klebsiellasp.LX3蔗糖異構酶的發(fā)現一致。綜合以上因素，以30℃為后續(xù)研究的反應溫度。

圖7 溫度對異麥芽酮糖產物得率的影響Fig.7 Effect of temperature on the yield of isomaltulose

2.3.2 初始pH對固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的影響 見圖8，當初始pH為4.5時，異麥芽酮糖產物得率最高，達到84.8%。推測pH可能影響酶活性部位有關基團的解離狀態(tài)，高于或低于最適pH值時，酶處于不利于催化的解離狀態(tài)。因此以4.5為最適pH。

圖8 初始pH對異麥芽酮糖產物得率的影響Fig.8 Effect of initial pH on the yield of isomaltulose

2.3.3 底物質量濃度對固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的影響 見圖9，底物質量濃度為500 g/L時，產物得率達87.9%。而以500～700 g/L蔗糖為底物時，雖然轉化率基本保持恒定，但考慮到高質量濃度的蔗糖時體系水活力較低，后續(xù)以質量濃度600 g/L的蔗糖進行試驗。

圖9 底物質量濃度對異麥芽酮糖產物得率的影響Fig.9 Effect of sucrose concentrations on the yield of isomaltulose

2.3.4 固定酶用量對固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的影響 見圖10，異麥芽酮糖轉化率隨著酶加量的增加而升高，當酶用量為15 U/g時，產物得率達到最大85.2%。但隨著酶用量的繼續(xù)增加，異麥芽酮糖轉化率稍微降低。故而以15 U/g為最優(yōu)酶加量。

圖10 加酶量對異麥芽酮糖產物得率的影響Fig.10 Effect of enzyme concentration on the yield of isomaltulose

2.3.5 反應時間對固定化蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的影響 見圖11，在轉化10 h時轉化率達到最大值87.8%，10 h后轉化率基本不變。因此，最佳轉化時間可以選擇為10 h。

圖11 反應時間對異麥芽酮糖產物得率的影響Fig.11 Effect of reaction time on the yield of isomaltulose

2.4 固定化酶的操作穩(wěn)定性研究

圖12為固定化酶連續(xù)轉化16次的產物得率與殘余酶活。固定化酶連續(xù)轉化10次，酶活保留率超過50%；連續(xù)轉化16次，產物得率仍有87.52%，顯示該固定化酶具有較好的操作穩(wěn)定性及較高的異麥芽酮糖合成能力。

圖12 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.12 Operational stability of immobilized enzyme

3 結語

本研究以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯劑，采用吸附交聯法對重組工程菌來源的蔗糖異構酶進行固定化。結果表明，最佳固定化條件：殼聚糖質量濃度3 g/dL、戊二醛加量0.75%、酶加量 50 U/g、固定化時間16 h，此時固定化酶活力回收率達到70.3%。重組酶制備異麥芽酮糖的最佳轉化條件：溫度 30 ℃、初始pH 4.5、酶用量 15 U/g，轉化 10 h，蔗糖質量濃度600 g/L，異麥芽酮糖最大產物得率可以達到87.8%。在最佳的轉化條件下連續(xù)轉化16次，產物得率無明顯降低，顯示該固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性及較高的異麥芽酮糖合成能力，為固定化酶法合成異麥芽酮糖的工業(yè)化提供了一定的參考價值。