胡春芹，龍 婧，周楠迪，田亞平

（1.江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

糖尿病是一種由多因素作用引發(fā)的高血糖代謝疾病，其基本發(fā)病機(jī)制主要為胰島素抵抗、氧化應(yīng)激作用、β細(xì)胞功能受損、細(xì)胞因子炎癥。糖尿病治療的作用機(jī)制主要是平衡胰島素的分泌與抵抗作用，維持胰島β細(xì)胞含量穩(wěn)定；糖分解過程中的關(guān)鍵酶控制也是一種有效途徑[1]。α-葡萄糖苷酶主要分布于小腸上皮黏膜上，屬于消化酶，在人體消化食物過程中，可降解乳糖、麥芽糖等一系列低聚糖，主要斷裂低聚糖非還原端α-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生α-葡萄糖。因此，可以通過具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質(zhì)競爭性減緩葡萄糖苷水解酶的催化，使小腸上皮細(xì)胞表面的α-葡萄糖苷酶作用降低，進(jìn)而降低碳水類化合物的吸收利用，有效緩解餐后血糖濃度，從而促進(jìn)糖尿病的治療。通過酶解法制備的自然界生物中的α-葡萄糖苷酶抑制劑既遵守安全綠色原則，又避免對(duì)人體形成二次傷害，且具有較強(qiáng)的抑制性，因此受到人們的密切關(guān)注[2-3]。

此外，鋅作為人體必需的礦物金屬之一，對(duì)機(jī)體非常重要。鋅的生物功能繁多，包括參與葡萄糖和脂質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖、免疫神經(jīng)系統(tǒng)和胰島素的合成等。Zn2+還被用作α-葡萄糖苷酶抑制劑研究，作為臨床代替治療Ⅱ型糖尿病的物質(zhì)[4]。多肽-鋅復(fù)合物作為一種有機(jī)鋅化合物，更接近于機(jī)體內(nèi)鋅的作用形式，能夠達(dá)到更好的營養(yǎng)補(bǔ)充效果。而且，多肽-鋅以多肽形式被人體所利用，減少與氨基酸吸收之間的競爭力，增強(qiáng)鋅的利用，發(fā)揮更多的生理作用[5-7]。楊杰等[8]研究發(fā)現(xiàn)，從魚蛋白中提取的小肽與螯合鋅后具有抗氧化和補(bǔ)鋅雙重效果。梅麗萍等[9]在研究臨床上檢測(cè)微量元素對(duì)腎病及糖尿病治療的意義時(shí)發(fā)現(xiàn)，血糖濃度與鋅的含量成反比。PAULE等[10]研究發(fā)現(xiàn)向糖尿病小鼠體內(nèi)注入2種特殊的肽（GHTD氨基化合物和類似物ISF402）與鋅配合物，降血糖能力比單獨(dú)使用胰島素強(qiáng)。

本研究旨在開發(fā)一種新型天然原料酶解活性肽，具備靶酶的抑制活性的同時(shí)螯合微量鋅，以利于快速吸收的形式為補(bǔ)充鋅和治療糖尿病提供一種更為穩(wěn)定、安全高效的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

條斑紫菜，購自南通千鶴食品有限公司；中性蛋白酶，購自蘇柯漢生物有限公司；堿性蛋白酶，購自廣西龐博有限公司；氨肽酶，為實(shí)驗(yàn)室自制；α-葡萄糖苷酶，購自源葉生物科技有限公司；4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷（PNPG），購自阿拉丁試劑；氯化鋅、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等，購自國藥化學(xué)試劑有限公司。

722型紫外可見分光光度計(jì)、原子吸收分光光度計(jì)，購自普析通用儀器有限責(zé)任公司；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫菜蛋白制備α-葡萄糖苷酶抑制多肽工藝流程 參考周鋒等[2]和高素蘊(yùn)等[11]的方法并在其基礎(chǔ)上改動(dòng)。將條斑紫菜烘干、粉碎，取33 g溶于1 L 0.02 mmol/L、pH 8.5的緩沖液中，沸水浴15 min。加入中性蛋白酶（E/S=8×104U/g）、堿性蛋白酶（E/S=8×104U/g）、氨肽酶（E/S=28 U/g），50 ℃下酶解 6 h，煮沸15 min滅酶，9000 r/min離心15 min去沉淀，稀釋1.6倍通過10×103的超濾膜，收集透過液，再通過1×103納濾膜，收集透過液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、凍干。

1.2.2 糖苷酶抑制劑活性肽-Zn螯合方法 紫菜酶解產(chǎn)物α-葡萄糖苷酶活性多肽、0.5 mmol/L的氯化鋅溶液調(diào)節(jié)pH、溫度、時(shí)間、質(zhì)量比，振蕩螯合，無水乙醇沉降，離心去上清液，烘干[12]。

1.2.3 不同酶與底物比、不同時(shí)間條件下體外模擬胃腸穩(wěn)定性 體外模擬胃腸消化過程中α-葡萄糖苷酶抑制穩(wěn)定性的方法參考杜芬等[13]和Cruz-Huerta等[14]的方法并在其基礎(chǔ)上略有改動(dòng)。胃腸消化過程共分為2個(gè)階段：胃消化和十二指腸消化。定量配制1 mg/mL的螯合多肽溶液，并將pH調(diào)到2.0（1 mol/L HCl）。37 ℃恒溫孵育 15 min，加入不同質(zhì)量的胃蛋白酶，37℃恒溫振蕩一定時(shí)間，將pH調(diào)至7.0（5 mol/L NaOH），終止胃蛋白酶反應(yīng)。十二指腸消化階段：將經(jīng)過胃消化階段的螯合多肽溶液置于37℃恒溫孵育15 min，按照Zn-螯合肽與酶不同質(zhì)量比加入胰蛋白酶，繼續(xù)37℃恒溫振蕩一定時(shí)間。置于85℃恒溫保溫20 min，終止十二指腸消化反應(yīng)。分別測(cè)定胃消化階段和十二指腸消化階段α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1.3 分析方法

1.3.1 螯合率的測(cè)定[15]采用火焰法原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定螯合前后Zn的總量分別為A1、A2，計(jì)算公式為：

1.3.2 糖苷酶抑制率的測(cè)定 采用4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷（PNPG）法。取3支試管，取一份待測(cè)樣品加入試管A中，一份0.5 mg/mL α-葡萄糖苷酶混合均勻，37℃水浴保溫10 min，再加入一份10 mmol/L PNPG反應(yīng)1 h后加入一份1 mol/L Nα2CO3終止反應(yīng)，在405 nm處測(cè)定吸光度Ai；試管B中用氯化鋅溶液替換PNPG溶液，吸光值為Aj；C管中取一份氯化鋅溶液替換待測(cè)樣品加入離心管中，操作同A試管，吸光值為A0，α-葡萄糖苷酶活性抑制率的測(cè)定公式為：

2 結(jié)果與討論

2.1 α-葡萄糖苷酶抑制多肽的制備

紫菜蛋白經(jīng)酶解、超濾、納濾等深加工后得到的α-葡萄糖苷酶抑制劑為小分子多肽類，主要集中在130～1000之間。所制備的多肽其質(zhì)量濃度在1 mg/mL時(shí)對(duì)0.5 mg/mL的α-葡萄糖苷酶（2×104U/g）的抑制率可以達(dá)到68%。張立新等[16]也曾研究報(bào)道刺參、海筒螅等海洋無脊椎動(dòng)物的提取物在1 mg/mL時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到68.5%和60.5%，可作為α-葡萄糖苷酶抑制劑提取的原料。

2.2 Zn2+對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制性

參照楊楊[17]研究高劑量補(bǔ)鋅對(duì)海馬鋅含量、BDNF和記憶力的影響時(shí)提出，人體補(bǔ)鋅量為15 mg/d，低劑量補(bǔ)鋅約10 ppm，高劑量補(bǔ)鋅約40 ppm，應(yīng)合適地補(bǔ)鋅，避免過量，本實(shí)驗(yàn)選擇Zn2+的濃度為0.5 mmol/L。測(cè)定單獨(dú)Zn2+溶液對(duì)于α-葡萄糖苷酶的影響，如下圖1。

圖1 Zn濃度對(duì)糖苷酶抑制率的影響Fig.1 Influence of znic concentration on inhibition activity

單獨(dú)的Zn2+對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，且隨著濃度的變化有一定的變化。在此濃度范圍內(nèi)，Zn2+對(duì)酶有一定的抑制作用，說明Zn可以作為治療糖尿病的有效物質(zhì)。

2.3 糖苷酶抑制多肽-Zn螯合工藝制備

糖苷酶抑制劑活性肽-Zn螯合單因素實(shí)驗(yàn)：以1 mg/mL螯合多肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率和螯合度為指標(biāo)，確定底物質(zhì)量濃度、pH、時(shí)間、溫度對(duì)螯合的影響。

2.3.1多肽質(zhì)量濃度對(duì)螯合反應(yīng)和抑制率的影響配置多肽質(zhì)量濃度為 2、4、6、8、10 mg/mL， 溶于 0.5 mmol/L，pH 4.5的ZnCl2溶液，37℃，水浴螯合 30 min，結(jié)果見圖2。

螯合率在一定質(zhì)量濃度（4 mg/mL）之前呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)，隨后呈現(xiàn)一定的下降。說明質(zhì)量濃度影響螯合反應(yīng)的進(jìn)行，質(zhì)量濃度較低時(shí)，Zn2+質(zhì)量濃度充足，可以最大程度地與多肽溶液螯合，多肽質(zhì)量濃度達(dá)到一定時(shí)，Zn2+的量不足以滿足螯合的進(jìn)行，螯合度有所降低。螯合多肽質(zhì)量濃度在1 mg/mL時(shí)對(duì)0.5 mg/mL的α-葡萄糖苷酶抑制率在4 mg/mL前隨著多肽質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)相應(yīng)的升高，之后也呈現(xiàn)很大幅度降低。說明在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)多肽-Zn作為一種有機(jī)鋅形式可以促進(jìn)糖苷酶抑制活性。隨著螯合度的降低，其抑制活性也相應(yīng)降低。綜合考慮，選擇最適的多肽質(zhì)量濃度為4 mg/mL。

圖2 多肽質(zhì)量濃度對(duì)螯合度和抑制活性的影響Fig.2 Influence of peptides concentration on chelation and inhibition activity

2.3.2 pH對(duì)螯合反應(yīng)和抑制率的影響 配置多肽質(zhì)量濃度為10 mg/mL，pH 分別為 4.0、4.5、5.0、5.5、6， 37 ℃，水浴螯合30 min，結(jié)果見圖3。

圖3 pH對(duì)螯合度和抑制活性的影響Fig.3 Influence of pH value on chelation and inhibition activity

pH值在4～5時(shí)螯合率快速升高，螯合多肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性相對(duì)穩(wěn)定，pH值5～6時(shí)螯合率逐漸下降，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性也略降低。說明H+的濃度影響多肽與鋅的螯合反應(yīng)，對(duì)于糖苷酶抑制活性的影響在一定pH范圍內(nèi)影響不大。H+大量存在時(shí)可能會(huì)競爭Zn的供電基團(tuán)，影響螯合反應(yīng)的進(jìn)行。pH到達(dá)5時(shí)螯合度最大。pH繼續(xù)增加時(shí)螯合率降低，可能是由于體系中OH+離子增加，競爭性結(jié)合 Zn2+，形成 Zn（OH）2沉淀。故選擇pH 5.0作為螯合的pH。

2.3.3 時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)和抑制活性的影響 配置10 mg/mL的多肽溶液，pH 4.5，37℃水浴螯合0.5、1、1.5、2.0、2.5 h，結(jié)果見圖4。

圖4 時(shí)間對(duì)螯合度和抑制活性的影響Fig.4 Influence of Time on chelation and inhibition activity

0.5～1.5 h，螯合率和α-葡萄糖苷酶抑制活性逐漸上升，且在1.5 h時(shí)達(dá)到最高，1.5 h之后，螯合率和抑制活性均有所降低。說明螯合實(shí)驗(yàn)中供電基團(tuán)和離子是動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)，并不停反應(yīng)的，一定時(shí)間之后，離子或者供電基團(tuán)飽和，螯合度不再增加，時(shí)間過長，影響螯合溶液中離子或者供電基團(tuán)的運(yùn)動(dòng)，螯合度降低，進(jìn)而影響α-糖苷酶抑制活性。因此選擇時(shí)間1.5 h進(jìn)行螯合。

2.3.4 溫度對(duì)螯合反應(yīng)和抑制活性的影響 配置多肽質(zhì)量濃度10 mg/mL，pH 4.5，分別置于30、37、40、50、60 ℃中水浴螯合 30 min，結(jié)果見圖5。

圖5 溫度對(duì)螯合度和抑制活性的影響Fig.5 Influence of Temperatureon chelation and inhibition activity

溫度在低于40℃時(shí)螯合度逐漸上升，40℃之后，螯合度基本穩(wěn)定，可能是因?yàn)轵鲜且粋€(gè)動(dòng)態(tài)過程，溫度升高有利于分子運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)螯合反應(yīng)的進(jìn)行。溫度大于40℃時(shí)，分子間運(yùn)動(dòng)較快，螯合反應(yīng)不受分子間力的變化而變化；溫度低于40℃時(shí)α-糖苷酶抑制活性逐漸上升。40℃時(shí)抑制活性達(dá)到最大，40℃之后，α-糖苷酶抑制活性緩慢降低，說明低溫影響α-糖苷酶抑制率活性，溫度升高不但可以激活多肽，還能促進(jìn)螯合進(jìn)行，發(fā)揮更好的抑制活性。溫度高于40℃時(shí)，影響多肽螯合物的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響抑制活性。因此，優(yōu)選溫度40℃進(jìn)行螯合反應(yīng)。

2.4 螯合反應(yīng)的正交實(shí)驗(yàn)分析

為了進(jìn)一步優(yōu)化螯合工藝，選擇溫度、時(shí)間、pH、多肽濃度4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，見表1。實(shí)驗(yàn)以1 mg/mL螯合肽對(duì)α-糖苷酶活性抑制率為指標(biāo)，進(jìn)行 L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table1 Factors and levels of chelation technology

表2 螯合反應(yīng)正交分析結(jié)果Table2 Chelate reaction results of orthogonal experiment

根據(jù)表2，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性影響的顯著次序?yàn)椋篋→C→B→A，即底物濃度＞pH＞溫度＞時(shí)間。α-葡萄糖苷酶抑制活性肽螯合鋅的最佳條件為：A2B1C1D3。用最優(yōu)實(shí)驗(yàn)組合再次實(shí)驗(yàn)，獲得螯合多肽的螯合度為25.6%，1 mg/mL的螯合活性肽對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為79.8%，因此螯合的最佳條件為：1.5 h，pH 4.5，37 ℃，6 mg/mL。

2.5 體外模擬胃腸穩(wěn)定性

胃腸消化模型主要是針對(duì)食品在消化過程中活性變化建立的，反映樣品在人體內(nèi)的消化吸收情況。本實(shí)驗(yàn)主要考察樣品對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性，反映Zn-糖苷酶抑制螯合活性肽在胃消化階段和十二指腸消化階段的抑制活性穩(wěn)定情況。由圖6模擬胃液消化過程可知，隨著時(shí)間和胃蛋白酶量的增加，抑制活性在一定范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，當(dāng)時(shí)間達(dá)到1.5 h，胃蛋白酶質(zhì)量∶活性肽質(zhì)量達(dá)到16時(shí)，抑制活性開始降低，但降低的幅度較小，說明糖苷酶抑制-Zn螯合肽在胃消化階段，具有較強(qiáng)的活性穩(wěn)定性。劉珊珊等[18]研究酪蛋白抗氧化肽的胃腸消化穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)經(jīng)過胃蛋白酶消化后，抗氧化活性出現(xiàn)顯著降低。CHEN等[19]研究發(fā)現(xiàn)蛋清蛋白肽在經(jīng)過胃腸消化階段后ACE抑制活性降低。糖苷酶抑制-Zn螯合肽經(jīng)過腸道消化階段穩(wěn)定性見圖7。

十二指腸消化階段，活性多肽的抑制率基本保持穩(wěn)定，抑制活性不隨時(shí)間和胰蛋白酶的質(zhì)量增加而降低，說明其對(duì)胰蛋白酶的耐受性也較好，α-葡萄糖苷酶抑制-Zn螯合活性肽在模擬胃腸消化過程中都能夠很好地保持α-葡萄糖苷酶的抑制活性，發(fā)揮正常的生物活性，并且可以作為功能成分提高礦物質(zhì)的吸收。

圖6 糖苷酶抑制-Zn螯合肽在模擬腸消化階段的穩(wěn)定性Fig.6 Stability of the chelate complex of Zn-peptide in the simulated gastric phase

圖7 糖苷酶抑制-Zn螯合肽在模擬腸消化階段的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of the chelate complex of Zn-peptide in the simulated intestinal phase

這些特性表征和其為一群分子量比較低，且有特定氨基酸序列的小肽組成有密切關(guān)系。

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)以紫菜為原料酶解制備的α-葡萄糖苷酶抑制活性肽與鋅螯合的最佳螯合條件為：時(shí)間1.5 h，pH 4.5，溫度 37 ℃，質(zhì)量濃度 6 mg/mL，螯合度為25.6%。得到的鋅螯合肽對(duì)0.5 mg/mL的α-葡萄糖苷酶抑制活性達(dá)到約79.8%，比未螯合的多肽α-葡萄糖苷酶抑制活性提高了17.35%倍，且模擬體外胃腸消化時(shí)抑制活性穩(wěn)定性較好，說明鋅螯合肽可以作為一種潛在的預(yù)防和治療糖尿病的保健食品。