潘小衛(wèi) ， 焦愛權(quán) ， 龍 杰 ， 閔丹丹 ， 金征宇 *

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

高粱在進(jìn)行小曲酒發(fā)酵前要經(jīng)過浸泡和蒸煮來使其中的淀粉糊化，該過程耗費(fèi)了大量的水電，增加了生產(chǎn)的總成本，并且產(chǎn)生的污水會對環(huán)境造成污染[1]。

擠壓膨化是一個(gè)連續(xù)的混合、膨化、成型過程，主要代替?zhèn)鹘y(tǒng)工藝的蒸煮步驟，高粱經(jīng)過粉碎后直接喂入擠壓機(jī)，經(jīng)過高溫高壓以及剪切作用后，淀粉能達(dá)到很高的糊化度，原料顆粒充分破碎，可以直接用于小曲酒的發(fā)酵。擠壓膨化不僅工藝簡單、節(jié)約能源、節(jié)約勞動力，還可以殺死原料中的有害微生物，避免發(fā)酵過程的雜菌污染[2]。

高粱經(jīng)擠壓過后變得粘稠堅(jiān)硬，從而不容易進(jìn)行糖化[3]，作者采用添加耐高溫α-淀粉酶的方式對擠壓過程進(jìn)行改進(jìn)，使擠壓機(jī)成為生化反應(yīng)器，物料膨化的同時(shí)還會在酶的作用下發(fā)生水解反應(yīng)，利于糖化反應(yīng)的進(jìn)行，同時(shí)還可以使淀粉在更低溫度得到更高的糊化度，避免由于高溫發(fā)生美拉德反應(yīng)使小曲酒產(chǎn)生焦糊味[4-6]。作者首先采用加酶擠壓的方式得到糊化高粱淀粉，然后進(jìn)行小曲酒發(fā)酵，比較了加酶擠壓、不加酶擠壓和蒸煮3種處理方式所得高粱淀粉物性和發(fā)酵性質(zhì)的差異，并通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對加酶擠壓工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期得到較高的產(chǎn)酒率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高粱：購于無錫市糧油市場；耐高溫α-淀粉酶：酶活120 KNU/g，諾維信（中國）公司產(chǎn)品；小曲：紫楓釀酒設(shè)備公司提供。

雙螺桿擠壓機(jī)：PTW-24/25D，德國熱電公司產(chǎn)品；雙螺桿自動進(jìn)料器：DDSR20N-PRISM，德國Brabender公司產(chǎn)品；AL204電子天平：梅特勒－托利多儀器公司產(chǎn)品；小型高速粉碎機(jī)6202：欣鎮(zhèn)企業(yè)有限公司產(chǎn)品；快速黏度分析儀：Techmaster，澳大利亞Newport Scientific公司產(chǎn)品；X-射線衍射儀D8-Advance，德國Bruker AXS公司產(chǎn)品；掃描電子顯微鏡：Quanta-200，荷蘭FEI公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理高粱用粉碎機(jī)粉碎，過30目篩，調(diào)節(jié)高粱水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，添加干基質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的耐高溫α-淀粉酶，混合后加入高粱粉中，攪拌10 min，于4℃冰箱放置12 h使水分分布平衡。擠壓過程中，設(shè)置4段擠壓機(jī)套筒溫度分別為60、70、80、95 ℃，擠壓機(jī)螺桿轉(zhuǎn)速為 150 r/min，喂料速度為1.5 kg/h。取擠出物100 g干燥粉碎后保存。其余樣品收集后用于小曲酒的發(fā)酵。

另取高粱粉碎，調(diào)節(jié)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，不加酶，擠壓過程以及收集情況同上。

另取高梁，浸泡48 h后用蒸汽蒸2 h至高粱淀粉全部糊化暴露，取100 g干燥粉碎后保存，其余用于小曲酒發(fā)酵。

1.2.2 小曲酒的發(fā)酵測出加酶擠壓、不加酶擠壓和蒸煮法得到的高粱樣品的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)[7]，稱取干基質(zhì)量為200 g的3種樣品，冷卻至30℃左右，加入4 g小曲，于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行固態(tài)，半固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵。其中，固態(tài)發(fā)酵直接調(diào)節(jié)樣品水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，而后直接進(jìn)行發(fā)酵；半固態(tài)發(fā)酵先是調(diào)節(jié)樣品水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%培菌糖化，再以料液質(zhì)量比1∶2補(bǔ)水進(jìn)行后發(fā)酵；液態(tài)發(fā)酵是直接以料液質(zhì)量比1∶2加入清水后進(jìn)行同步糖化和發(fā)酵。

1.2.3 乙醇產(chǎn)量和出酒率由于1分子葡萄糖在產(chǎn)生1分子乙醇的同時(shí)會排放1分子的CO2，可以根據(jù)發(fā)酵過程樣品的CO2失重M來換算出乙醇產(chǎn)量EY，這種方法可以連續(xù)的測定發(fā)酵酒體乙醇產(chǎn)量的變化[8]。

由乙醇產(chǎn)量EY，原料質(zhì)量m和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω可計(jì)算出產(chǎn)酒率θ：

1.2.4 樣品糊化性質(zhì)的測定淀粉的糊化度和粘度均可以用RVA儀同時(shí)測定，這是一種快速有效測定淀粉糊化度的方法。首先，用RVA儀先測定樣品的RVA曲線，取專用鋁盒，加入20 mL去離子水，加入計(jì)算好質(zhì)量的樣品得到干基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的混合懸濁液，迅速將鋁盒放入RVA儀內(nèi)進(jìn)行分析，得到樣品的RVA曲線，算出樣品峰值粘度，終值粘度和回復(fù)值。

由于RVA曲線上的峰主要由未糊化淀粉的糊化產(chǎn)生，所以可以在RVA曲線上作基線，求出原高粱粉末的峰面積S0，樣品RVA的峰面積S1，由以下公式得到糊化度GE[9]。

1.2.5 掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡的電壓設(shè)定為5 kV，放大倍數(shù)設(shè)定為2 400倍，樣品用戊二醛固定后用磷酸緩沖液漂洗，再用鋨酸固定并再次漂洗，臨界點(diǎn)干燥后用離子濺射法鍍膜，置于掃描電鏡內(nèi)觀察[10]。

1.2.6 X-射線衍射（XRD）稱取樣品1 g，采用標(biāo)準(zhǔn)片制備，測試條件為：管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描范圍 5～40°，掃描速度 5°/min。

1.2.7 響應(yīng)面設(shè)計(jì)（RSM）根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，采用中心組合設(shè)計(jì)，以乙醇產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，對水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、套筒溫度（X2）、加酶量（X3）進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Coded values of the variables

1.2.8 數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert v8.0軟件和MDI Jade 6.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、分析，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理方式對高粱物性的影響

2.1.1 微觀結(jié)構(gòu)圖1是不同處理方式所得高粱淀粉的掃描電鏡圖像，高粱原淀粉的微觀結(jié)構(gòu)見圖1（a）所示，呈類圓形，顆粒較大，直徑在 10～20 μm之間[11]。

b、c、d分別是蒸煮，不加酶擠壓和加酶擠壓過后的高粱淀粉，3種處理方法都較大的改變了淀粉的形態(tài)，使淀粉發(fā)生不同程度的破碎和降解。蒸煮處理相對于擠壓處理較為柔和，淀粉顆粒變化主要由蒸汽和熱作用形成，淀粉顆粒膨脹分裂，形成了相對豐富的微孔，有利于發(fā)酵的進(jìn)行。不加酶擠壓時(shí)高粱受到了高溫高壓和強(qiáng)烈的剪切作用，淀粉顆粒完全被破壞，物料從模頭擠出時(shí)發(fā)生了劇烈的膨化，但是物料在冷卻過程中迅速萎縮，形成了致密、堅(jiān)硬的結(jié)構(gòu)，可能會對后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響。在擠壓過程中添加耐高溫α-淀粉酶，淀粉膨化的同時(shí)發(fā)生降解，表面形成不規(guī)則的層狀結(jié)構(gòu)，且出現(xiàn)了孔洞，便于微生物的生長利用，較傳統(tǒng)擠壓有著更大的優(yōu)勢。

圖1 不同高粱淀粉SEM圖像Fig.1 SEM images of different sorghum starches

2.1.2 結(jié)晶性質(zhì)和高粱原淀粉類似，處理后的高粱淀粉的主要特征衍射峰出現(xiàn)在 15°、17°、18°和23°處，表現(xiàn)出典型的A型淀粉特征，3種處理淀粉在22°左右均出現(xiàn)新的衍射峰，有著向B型淀粉轉(zhuǎn)化的趨勢[12]，結(jié)果見圖2。由x-射線衍射圖計(jì)算出蒸煮、不加酶擠壓和加酶擠壓處理的3種高粱淀粉的相對結(jié)晶度分別為9.53%、10.89%和6.96%，加酶擠壓所得淀粉的相對結(jié)晶度比不加酶的低，因?yàn)閿D壓過后的高粱淀粉冷卻過程中直鏈和支鏈淀粉分子的分支在氫鍵作用下趨向于平行排列，形成與原淀粉相似的結(jié)構(gòu)，而經(jīng)過酶解的高粱淀粉的淀粉鏈?zhǔn)艿狡茐?，難以形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，因而不易回生，具有較低的結(jié)晶度。

圖2 不同高粱淀粉XRD譜圖Fig.2 XRD patterns of different sorghum starches

2.1.3 粘度特性擠壓和蒸煮過程中高粱淀粉發(fā)生了不同程度的糊化，改變了原料的粘度，使其在發(fā)酵過程中表現(xiàn)出不同的特性。如圖3所示，原高粱顆粒堅(jiān)硬，生淀粉含量高，峰值粘度高達(dá)7 825 mPa·s。蒸煮處理能有效的降低高粱的粘度，但是蒸煮處理的高粱淀粉回生值高達(dá)4 682 mPa·s，可能會對后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生不良影響，不加酶擠壓和加酶擠壓的高粱淀粉回生值分別為448 mPa·s和4 mPa·s，說明擠壓蒸煮高粱熱穩(wěn)定性高，淀粉不易回生，有利于發(fā)酵。加酶擠壓高粱淀粉的峰值粘度僅有163 mPa·s，有效的解決了擠壓物料粘度大，分散性差的缺點(diǎn)。

2.1.4 糊化特性由圖3的RVA曲線糊化峰面積可以換算出高粱淀粉的糊化度，為了和蒸煮溫度相近，選擇的擠壓溫度為95℃。不加酶擠壓所得高粱淀粉糊化度為51.27%，而加酶擠壓由于高粱邊擠壓邊受到酶的作用，淀粉顆粒充分水解，所以糊化度高達(dá)99.36%，擠壓過程中添加耐高溫α-淀粉酶能將糊化效率提高近一倍[13]，所以可在較低溫度下使物料得到較高的糊化度，防止溫度較高產(chǎn)生美拉德反應(yīng)等使物料產(chǎn)生焦糊味。相比之下，蒸煮處理糊化度為46.06%，工序復(fù)雜但是處理效果卻低于擠壓處理，這表明擠壓膨化在發(fā)酵原料預(yù)處理方面具有極大的優(yōu)勢。

2.2 小曲酒發(fā)酵結(jié)果

將3種處理方式得到的高粱樣品進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)酒率如表2所示，不論采用哪種發(fā)酵方式，擠壓膨化高粱的產(chǎn)酒率均高于傳統(tǒng)的蒸煮高粱。當(dāng)采用液態(tài)發(fā)酵時(shí)，由于加酶擠壓高粱的粘度最低，所以其分散性最佳，產(chǎn)酒率達(dá)到了50.65%。固態(tài)發(fā)酵時(shí)加酶擠壓高粱的優(yōu)勢卻不明顯，產(chǎn)酒率只有47.82%，可能是受到產(chǎn)物抑制作用的影響。

圖3 不同高粱淀粉RVA曲線Fig.3 Viscosity curves of different sorghum starches

表2 不同發(fā)酵方式產(chǎn)酒率Table 2 Efficiency of different fermentation methods%

圖4 半固態(tài)發(fā)酵速度-時(shí)間曲線Fig.4 Speed-time curve of Semi-solid fermentation

半固態(tài)發(fā)酵是一種有效解決乙醇產(chǎn)物抑制的方法[14]，圖4是3種高粱原料進(jìn)行半固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵速率-時(shí)間圖像，在發(fā)酵6 d左右，3種預(yù)處理高粱發(fā)酵速率都降低到最低點(diǎn)，此時(shí)通過添加2倍投料量的清水，發(fā)酵速度均有了明顯的提升，由于加酶擠壓高粱的水溶性較高，加水之后迅速分散成懸濁液，且半固態(tài)發(fā)酵有效解決了其發(fā)酵中期的酒精抑制，所以其發(fā)酵速率提升最為明顯，加酶擠壓高粱經(jīng)過半固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)酒率達(dá)到了92.23%。

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.3.1 試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，以酒精產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、套筒溫度（X2）、加酶量（X3）為變量，采用Design-Expert v8.0軟件設(shè)計(jì)了三因素五水平共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，方案和結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results for response surface analysis

2.3.2 模型分析運(yùn)用Design-Expert v8.0軟件，對表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次項(xiàng)擬合，得到了產(chǎn)酒量（Y）對水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、?？跍囟龋╔2）、加酶量（X3）的二次回歸方程：

模型方差分析如表4所示，可以看出，模型的P值小于0.000 1，說明響應(yīng)面模型極其顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，該模型擬合度較好，可以用來預(yù)測加酶擠壓高粱進(jìn)行小曲酒發(fā)酵的出酒率[15]。

經(jīng)過最優(yōu)點(diǎn)分析，得到了加酶擠壓高粱最優(yōu)工藝條件為：物料水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)33.28%，套筒溫度98.40℃，加酶量1.62‰。每40 g高粱小曲酒發(fā)酵酒精產(chǎn)量預(yù)測值為12.22 g，相同條件實(shí)驗(yàn)得酒精產(chǎn)量為12.34 g，誤差為0.98%，實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值基本一致，說明優(yōu)化效果顯著，進(jìn)一步說明了模型的可靠性。

表4 響應(yīng)值二次模型的方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed quadratic regression model

3 結(jié) 語

利用加酶擠壓的方式改進(jìn)傳統(tǒng)擠壓膨化工藝，由于耐高溫α-淀粉酶的水解作用，加酶擠壓高粱的淀粉顆粒破壞度更高，結(jié)晶度降低至6.96%，糊化度高達(dá)99.36%，且使得高粱淀粉的粘度降低了近100倍，有效的解決了膨化高粱在小曲酒發(fā)酵時(shí)由于粘度過高而糖化困難的問題。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加酶擠壓高粱更適合進(jìn)行半固態(tài)發(fā)酵，這種先培菌后發(fā)酵的模式有效解決了其發(fā)酵中期酒精抑制的問題，通過響應(yīng)面優(yōu)化擠壓參數(shù)后的高粱產(chǎn)酒率達(dá)到了93.73%。本研究是對工藝的改進(jìn)，而小曲酒的風(fēng)味也是其很重要的特征，因此后續(xù)將對加酶擠壓小曲酒成分進(jìn)行檢測分析。