劉 璐， 張志才*，2， 樊亞娟， 胡坤雅， 汪 佳

（1.江蘇大學(xué)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)加工工程研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.北京綠科天成生物有限公司，北京 102300）

秸稈轉(zhuǎn)變成生物質(zhì)能源包括4個(gè)步驟：秸稈的預(yù)處理、秸稈纖維素的糖化、發(fā)酵和生物能源的提取。其中纖維素糖化，即把秸稈中的纖維素轉(zhuǎn)變成可發(fā)酵的己糖[1-3]，是秸稈開發(fā)利用生產(chǎn)清潔能源過程中一個(gè)極其重要步驟。秸稈中的纖維素糖化反應(yīng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程，為探究其行為機(jī)理需要進(jìn)行動(dòng)力模型學(xué)研究，利用該模型研究影響酶水解效率的因素及規(guī)律[4]。

由于纖維素酶水解過程是異相反應(yīng)，且反應(yīng)速率常數(shù)不斷降低，準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)理論不成立，再加上酶水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)較復(fù)雜，不能采用傳統(tǒng)的米氏方程進(jìn)行描述[5]。而米氏方程模型僅適用于均相體系中，許多生物催化反應(yīng)發(fā)生在非均相系統(tǒng)中，受到擴(kuò)散與傳質(zhì)，反應(yīng)物分子、產(chǎn)物分子與催化劑表面發(fā)生的吸附、傳遞、脫附、酶變性等影響[6-7]。因此，無法用傳統(tǒng)的米氏方程理論描述非常規(guī)的反應(yīng)[8]，需要對(duì)模型進(jìn)行修改以描述非均質(zhì)系統(tǒng)中的酶反應(yīng)[9]。

Kopelman等認(rèn)為非均相反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)不遵從經(jīng)典動(dòng)力學(xué)模型，速率常數(shù)隨著時(shí)間而變，速率常數(shù)與反應(yīng)級(jí)數(shù)和譜維數(shù)有關(guān)，酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)屬于類分形動(dòng)力學(xué)模型[10-11]。Priit V?ljam?e采用類分形動(dòng)力學(xué)研究了里氏木霉的水解過程，同時(shí)提出類分形動(dòng)力學(xué)可能也適用于纖維素的酶解過程[12]。Huang研究了不同濃度的不溶性酶對(duì)不同濃度的底物水解，提出了快速吸附的動(dòng)力學(xué)模型，并討論了確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法[13]。

而IMM的研究對(duì)象是復(fù)雜、抽象和未簡化的非線性系統(tǒng)，不僅可以認(rèn)識(shí)其內(nèi)在規(guī)律、反映事物的內(nèi)在本質(zhì)，還可以簡化研究過程。簡化的動(dòng)力學(xué)模型使用Kobs，0來考慮預(yù)處理前后底物酶的初始活性和可及性，Ki表現(xiàn)出由酶對(duì)惰性和非反應(yīng)性物質(zhì)的阻礙反應(yīng)引起的酶活性逐漸喪失的異構(gòu)系統(tǒng)，IMM可以清晰反應(yīng)纖維素酶水解的反應(yīng)過程。對(duì)此，作者選擇IMM研究了不同反應(yīng)條件對(duì)纖維素糖化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，以獲得最大糖得率，為木質(zhì)纖維素的糖化奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

纖維素：購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；纖維素酶：購自和氏璧生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)力學(xué)模型

纖維素的糖化反應(yīng)發(fā)生于非均相體系，反應(yīng)過程可以用下列方程表示：

其中S，P和ES分別表示底物、產(chǎn)物，和酶-底物復(fù)合物。k1和k2是指正向反應(yīng)速率常數(shù)，k-1表示反向反應(yīng)速率常數(shù)。模型假設(shè)：（i）與酶反應(yīng)相比，固體底物對(duì)酶的吸附速率更快，（ii）酶的反應(yīng)受阻主要包括產(chǎn)物抑制，基質(zhì)對(duì)酶非反應(yīng)位點(diǎn)的吸附作用，以及酶的質(zhì)量轉(zhuǎn)移阻力，（iii）酶反應(yīng)被認(rèn)為是酶（E）與底物的結(jié)合形成酶-底物復(fù)合物，（iv）預(yù)處理對(duì)固體底物結(jié)構(gòu)的影響通過相應(yīng)的反應(yīng)速率即k1，k-1和k2反映出來。基于以上假設(shè)，在反應(yīng)過程中，當(dāng)[ES]處于準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)，對(duì)于[ES]有，μ分解=μ合成，μ分解=（k-1+k2）[ES]，μ合成=k1[E][S]，由此得到[ES]=[E][S]/Km，這里Km=（k-1+k2）/k1。 因此，產(chǎn)物的生成速率可以表示為：

產(chǎn)物和底物達(dá)到平衡時(shí)，

式（2）中：[S0]表示底物初始濃度。 因?yàn)閇ES]＜＜[P]+[S]，所以[ES]可忽略。 （2）可簡化為下式：

公式（3）代入公式（1），化簡得到下列公式（4）：

令[P]/[S0]=Ytrs，代入式（4）中。

公式（5）中k2[E0]/Km=Kobs，0，且Kobs，0取決于底物預(yù)處理的效果，酶對(duì)底物的可及性以及酶在固體基質(zhì)中的活性。非均相反應(yīng)體系中的糖化反應(yīng)由于底物的不可溶解性導(dǎo)致酶與底物接觸面積過小而使得反應(yīng)速率很慢。因此，酶的活性受到阻礙，酶的水解速率逐漸減小。阻礙的反應(yīng)可由下式表示出來，其中，Ki表示水解過程中無效酶的系數(shù)，Ei表示無效酶。阻礙反應(yīng)可通過如下一階方程表示：

隨著反應(yīng)的進(jìn)行，可與酶反應(yīng)的底物隨著時(shí)間的增大而減少。基于對(duì)實(shí)驗(yàn)的觀察，Ki可用隨時(shí)間變化的下列函數(shù)表示：

酶的物料平衡組成為：

式（8）中，[E0]，[E]，[ES]，[Ei]指初始酶濃度，自由酶的濃度，一個(gè)酶-底物復(fù)合物的濃度，一個(gè)無效酶的濃度。 式（8）對(duì)時(shí)間求導(dǎo)，得式（9）。

因?yàn)閇ES]復(fù)合物被假設(shè)為穩(wěn)定態(tài)且d[ES]/dt≈0，所以，式（9）可被簡化為下式。

將公式（7）帶入公式（10）中，得下式。

公式（11）進(jìn)行積分，得[E]/[E0]=1/（1+αt）2，帶入式（5），得下式。

對(duì)公式（12）整理并積分給出下列公式。

對(duì)式（13）進(jìn)行變形，得下式。

式（14）中，兩邊同時(shí)被t除，得到的t項(xiàng)和常數(shù)項(xiàng)系數(shù)分別為 α/Kobs，0和 1/Kobs，0，Ki可由式（7）進(jìn)行計(jì)算，預(yù)測的Ytrs（Ytrs，pred）可由下式計(jì)算。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由試驗(yàn)得到條件溫度、pH、底物質(zhì)量濃度和酶質(zhì)量濃度對(duì)糖得率影響最大，因此設(shè)計(jì)4因素3水平的29組的Box-Behnken試驗(yàn)，研究溫度（A）、pH（B）、底物質(zhì)量濃度（C）和纖維素酶質(zhì)量濃度（D）對(duì)糖得率Ytrs的影響，并采用Design Expert 8.0.1、SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析[14-17]，通過比對(duì)各因素顯著性篩選出最適合水解的條件，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)因素及水平見表1。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析、方差分析。

為了探究Ytrs與Kobs，0、Ki相關(guān)性， 利用 SPSS 17.0軟件對(duì)其進(jìn)行分析，通過顯著性判斷因素之間是否相關(guān)，獲得方程，并解出方程，討論三者之間的關(guān)系，獲得最大糖得率。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案Table 1 Box-Behnken design of response surface design

1.4 分析方法

1.4.1 纖維素酶水解將纖維素與纖維素酶在pH 4.8 0.1 mol/L的乙酸鹽緩沖液混合后，加到100 mL三角瓶中用DNS法[18]測定初始還原糖質(zhì)量濃度為C0。在50℃，120 r/min水浴搖床中的振蕩糖化，分別于 0、1、2、4、8、16、32 h 取樣，并將樣品冰浴冷卻。取樣品與離心管中，4 000 r/min離心15 min，取上清液測定還原糖含量和酶活。

1.4.2 還原糖的測定采用3，5-二硝基水楊酸法[19]。

總還原糖的產(chǎn)量（Ytrs）根據(jù)下列公式計(jì)算：

其中，V為反應(yīng)體系的體積（mL），G為底物質(zhì)量（g），C0、C1分別為反應(yīng)前后還原糖質(zhì)量濃度（g/mL）。

所有試驗(yàn)均經(jīng)過3次平行試驗(yàn)，結(jié)果以平均值來表示。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均經(jīng)過3次平行試驗(yàn)，結(jié)果以平均值來表示，試驗(yàn)結(jié)果采用EXCEL 2007和SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件來處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 模型擬合結(jié)果分析

影響酶反應(yīng)速率的因素主要包括反應(yīng)溫度、溶液的pH、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和基質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。試驗(yàn)選擇響應(yīng)面分析研究了這些因素的單獨(dú)作用和交互作用對(duì)酶反應(yīng)速率的影響。4因素3水平29組試驗(yàn)的BBD運(yùn)行，反應(yīng)不同時(shí)間還原糖得率的結(jié)果顯示在表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)運(yùn)行結(jié)果Table 2 Run results of Box-Behnken design of response surface design

用IMM模型 （公式14）擬合表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到表3。

從表3可以看出，所有擬合的R2都高于0.96，并且與adj-R2值極其接近，p＜0.001，說明IMM模型能很好的擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而且具有較高的解釋率和可信度。通過擬合的方程得到的Kobs，0和Ki也顯示在表4。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)運(yùn)行結(jié)果的模型擬合分析Table 3 Model fitting analysis of the run results of Box-Behnken design of response surface design

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

從表3可見，反應(yīng)時(shí)間32 h的糖得率最高，因此試驗(yàn)選擇 32 h 的糖得率（Ytrs）和表 4 中的Kobs，0和Ki作為響應(yīng)值，分析了反應(yīng)溫度，pH，底物質(zhì)量濃度和纖維素酶質(zhì)量濃度單獨(dú)作用和交互作用對(duì)這3個(gè)響應(yīng)值的影響。采用下列方程擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

其中Y是預(yù)測響應(yīng)值（Ytrs，Kobs，0和Ki）；β0是常數(shù)；βi是單獨(dú)作用系數(shù)；βij是不同因素間XiXj交互作用系數(shù)，βii同一因素之間交互作用系數(shù)；Xi和Xj表示自變量值。擬合結(jié)果顯示在表5。

方差分析的結(jié)果如表5所示。四元二次模型的p＜ 0.05，Ytrs值，Kobs，0和Ki的F值分別為15.52，9.65和3.03，表明模型非常顯著。模型的失擬項(xiàng)“Prob ＞F”值分別為 0.054 3，0.856 6，0.052 6 均大于0.05，即失擬項(xiàng)不顯著，因此模型具有統(tǒng)計(jì)意義。將表5中的各項(xiàng)系數(shù)分別帶入方程（17），得到下列方程：

表4 二次響應(yīng)面模型的方差分析Table 4 ANOVA analysis for quadratic response surface

采用Design Expert 8.0.1軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。模型的“Prob＞F”的p值小于0.000 1，表明模型是顯著的。在響應(yīng)值為Ytrs的模型中，顯著項(xiàng)為B，C，D，CD，A2，B2，C2， 在響應(yīng)值為Kobs，0的模型中，顯著項(xiàng)為A，C，D，在響應(yīng)值為Ki的模型中，顯著項(xiàng)為A，A2，B2。因此響應(yīng)值為Ytrs模型中包含兩個(gè)線性項(xiàng)（B，C，D），一個(gè)交互項(xiàng)（CD），三個(gè)交互項(xiàng)（A，B和C）； 響應(yīng)值為Kobs，0模型包含兩個(gè)線性項(xiàng)（A，C，D）；響應(yīng)值為Ki模型包含兩個(gè)線性項(xiàng)（A），和兩個(gè)二次項(xiàng)（A2，B2）。

2.3 單因素作用分析

2.3.1 溫度對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)的作用纖維素酶水解是一種化學(xué)反應(yīng)，以分子運(yùn)動(dòng)為基礎(chǔ)，以酶分子與底物分子的吸附、絡(luò)合和解離為基礎(chǔ)，分子動(dòng)能與溫度直接相關(guān)，且酶是生物催化劑，具有溫度效應(yīng)，影響酶解率[20]。在40～48℃之間，溫度升高，糖得率逐漸增大，無效酶（Ki）逐漸降低，在48℃時(shí)，獲得最大糖得率和最低的無效酶；當(dāng)溫度超過48℃時(shí)，酶以失活為主無效酶逐漸增大，糖得率逐漸降低。在整個(gè)試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)隨著溫度升高，Kobs，0一直保持增加趨勢，說明增加溫度有利于增加酶與底物的可及性，提高酶的利用率。多數(shù)研究顯示，纖維素酶作用底物的最佳溫度范圍為 40～65℃[21]，與實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論一致。

2.3.2 pH對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)的作用酶在一定的pH范圍內(nèi)才具有較高的催化活性，因此糖得率隨pH變化的曲線呈拋物線形狀。當(dāng)pH＜4.5時(shí)，隨pH值增加，糖得率逐漸增加，而無效酶逐漸減少；當(dāng)pH=4.5時(shí)，糖得率取得最大值，而無效酶取得最低值；當(dāng)pH＞4.5，纖維素酶變性，較高的pH值會(huì)破會(huì)酶的空間結(jié)構(gòu)，影響酶活性部分的解離狀態(tài)，因此隨著pH升高，雖然會(huì)保持蛋白質(zhì)的天然性質(zhì)，卻失去了應(yīng)有的活性[22]，導(dǎo)致無效酶活性增加，因此糖得率也隨之減少。在pH在4.5時(shí)，糖得率取得最大值和無效酶取得最低值，證明pH的變化，通過影響纖維素酶的活力實(shí)現(xiàn)。在整個(gè)試驗(yàn)pH范圍內(nèi)隨著pH升高，Kobs，0一直保持增加趨勢，說明增加pH有利于增加酶與底物的可及性，提高酶的利用率。研究顯示，最適 pH值范圍為 4.0～5.5。

2.3.3 底物質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)的作用增加底物質(zhì)量濃度，盡管增加了酶與底物總的可接性，但是對(duì)于單位質(zhì)量的底物來說，其相對(duì)可接性（Kobs）是變小了，同時(shí)由于底物質(zhì)量濃度增加，單位質(zhì)量的酶失活作用（Ki）也表現(xiàn)的減少，因此導(dǎo)致單位底物的糖得率降低。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度較低，吸附到底物上的酶較少，大多數(shù)酶成游離狀態(tài)，底物處于飽和吸附狀態(tài)，因此當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度增加，酶的可接性增加，底物吸附酶總量增加，但是單位重量的底物吸附的酶量減少，因而總的還原糖得率也降低。底物質(zhì)量濃度增加，酶與底物的接觸面積越大，酶解率提高。已有研究證明酶催化反應(yīng)不是底物質(zhì)量濃度越高越好，底物質(zhì)量濃度越高，意味著酶溶液體積相對(duì)變小，造成反應(yīng)產(chǎn)物不易擴(kuò)散，會(huì)抑制酶的水解，嚴(yán)重降低水解速率。

2.3.4 酶質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)的作用在一定酶質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，增加底物質(zhì)量濃度，可以增加單位底物酶可接性，因此在整個(gè)試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著酶質(zhì)量濃度增加，Kobs，0逐漸增加，酶質(zhì)量濃度增多，導(dǎo)致酶非反應(yīng)位點(diǎn)之間的吸附以及游離酶的增加，即單位底物無效酶（Ki）含量也在逐漸增加。因此隨著酶質(zhì)量濃度增加，糖得率增加是由于單位底物的酶可接近性增加產(chǎn)生。許多文獻(xiàn)報(bào)道纖維素分子能和酶分子的結(jié)合點(diǎn)數(shù)有限，當(dāng)這些結(jié)合點(diǎn)全部被酶分子占據(jù)后，再增加纖維素用量，起不到酶解作用。

2.4 交互作用分析

在響應(yīng)面分析中，等高線通常用于研究各種因素之間的交互作用，分析等高線圖，可以獲得最優(yōu)響應(yīng)值時(shí)各因素的取值。表5顯示，只有CD（酶溶度和底物濃度）交互作用達(dá)到顯著水平，說明其對(duì)糖得率影響顯著。因此分析了這兩個(gè)因素的交互作用。圖1顯示在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，酶質(zhì)量濃度越高，底物質(zhì)量濃度越低，其糖得率越高。該結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

通過對(duì)回歸方程18，19和20求解，得到獲得最大Ytrs的條件為：pH 4.4，水解溫度47℃，纖維素酶質(zhì)量濃度為3 g/dL，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%。預(yù)測最大糖得率為0.485 4。可獲得最大Kobs，0的條件為：pH 7，水解溫度60 ℃，纖維素酶質(zhì)量濃度為3% ，底物質(zhì)量濃度5 g/dL。 預(yù)測最大Kobs，0為 0.474 0 h-1。 可獲得最小Ki值的條件為：pH 4.47，水解溫度47.40 ℃，纖維素酶質(zhì)量濃度為1 g/dL，底物質(zhì)量濃度5 g/dL，預(yù)測最小Ki值為0.055 8 h-1。綜上所述，獲得最大Ytrs，Kobs，0最小Ki的最優(yōu)條件為：pH 4.84， 溫度48.9 ℃，纖維素酶質(zhì)量濃度3 g/dL，底物質(zhì)量濃度5 g/dL。

圖1 酶質(zhì)量濃度和底物質(zhì)量濃度對(duì)糖得率影響的響應(yīng)面等高線圖Fig.1 Response surface plot combined effects of Enzyme concentration and Substrate concentration ratio on Sugar yield

2.5 Ytrs，Kobs，0 和 Ki的關(guān)系分析

因?yàn)镵obs，0等于k2[E0]/Km，[E0]是纖維素酶初始濃度，在實(shí)驗(yàn)中是常數(shù)，Kobs，0與k2[E0]/Km成比例。k2是從酶-底物復(fù)合物到最終產(chǎn)物正向反應(yīng)的速率常數(shù)。k2越大，Ytrs越大。米氏常數(shù)Km越小，親和力越大。因此，可以推斷Ytrs與Kobs，0呈正相關(guān)。Ki是水解反應(yīng)期間無效酶的系數(shù)，因此較低的Ki表示較少的無效酶和更多的有效酶。因此，Ytrs與Ki是負(fù)相關(guān)。為了驗(yàn)證這兩個(gè)推導(dǎo)，以表3中32小時(shí)糖得率為因變量，表4中的kobs，0和Ki為自變量，采用下列方程（21）進(jìn)行非線性回歸分析：

其中，a，b，c和d分別為（Kobs，0）2，Kobs，0，（Ki）2和Ki的系數(shù)，e為常數(shù)。表 5顯示F試驗(yàn)的F值（68.304）和t檢驗(yàn)的p值（0.000）表明Ytrs與Kobs，0、Ki相關(guān)性非常顯著，分析的可信度極高。R2為0.919，高于R2為0.80的置信度[27]，以上均表明本模型的可預(yù)測性相對(duì)更可靠。調(diào)整R2為0.906，接近R2值，即模型具有良好適應(yīng)性。

表6所有參數(shù)的系數(shù)均非常顯著（p=0.000）。其中（Kobs，0）2和（Ki）2的系數(shù)為負(fù)值證明Ytrs和Kobs，0或Ytrs和Ki的關(guān)系曲線呈現(xiàn)倒U形，Ytrs具有最大值。在將表5中的每項(xiàng)的系數(shù)引入等式（21）之后，得下式。

分別對(duì)Kobs，0、Ki求導(dǎo)得式（23）、（24）

令Ytrs′=0，Kobs，0=0.450 9 和Ki=0.053 8。 當(dāng)Kobs，0＜0.450 9，Ki＜ 0.053 8 時(shí)，Ytrs′＞ 0，即Ytrs與Kobs，0和Ki顯著正相關(guān)。 相反，Kobs，0＞ 0.450 9 和Ki＞ 0.053 8，Ytrs′＜ 0， 即Ytrs與Kobs，0和Ki顯著負(fù)相關(guān)。 當(dāng)Kobs，0=0.450 9，Ki=0.053 8 時(shí)，Ytrs達(dá)到最大值 0.604 0。 在表中，Kobs，0值大部分小于 0.450 9， 所有Ki值大于0.053 8，因此Ytrs與表征酶的初始活性和酶與底物的可及性的Kobs，0顯著正相關(guān)，與無效酶的系數(shù)Ki顯著負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)語

對(duì)纖維素酶水解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，建立了簡單的動(dòng)力學(xué)模型，響應(yīng)面設(shè)計(jì)給出了獲得最大Ytrs和Kobs，0以及最小Ki的條件。分析了不同因素在水解過程中對(duì)糖得率的影響和各因素之間的交互作用對(duì)糖得率的影響。獲得最大糖得率的條件為pH 4.41，溫度47℃，纖維素酶質(zhì)量濃度3 g/dL和底物質(zhì)量濃度5 g/dL。在最優(yōu)條件下，最大Ytrs為0.4854，與實(shí)驗(yàn)所獲得最大糖得率的0.442 9接近。溫度和pH主要通過改變無效酶系數(shù)影響糖得率，而酶和底物質(zhì)量濃度主要改變酶對(duì)底物的可接性作用于糖得率；并進(jìn)行了糖得率與動(dòng)力學(xué)各參數(shù)之間的回歸線性分析，得到相關(guān)性大于0.9的結(jié)果。在試驗(yàn)條件下，Ytrs與Kobs，0正相關(guān)，與Ki負(fù)相關(guān)。