李季楠，胡 浩，吳雪嬌，吳 艷*

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

葉黃素是一種含氧類(lèi)胡蘿卜素，天然存在于眾多食品中，如蛋黃、菠菜、甘藍(lán)和玉米等，具有極強(qiáng)的著色能力，賦予食物紅色、橙色和黃色外觀；同時(shí)葉黃素是一種脂溶性功能活性成分，具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病和癌癥等慢性疾病的生理功能[1]，另外，葉黃素和玉米黃素能夠在人眼視網(wǎng)膜黃斑部位沉積，作為抗氧化劑或光保護(hù)劑過(guò)濾進(jìn)入眼部的藍(lán)光，預(yù)防白內(nèi)障和老齡性黃斑變性[2]；但是，葉黃素分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)共軛雙鍵，易受光、熱、氧氣、金屬離子、酸性條件和其他促氧化劑的影響發(fā)生降解或異構(gòu)化，導(dǎo)致生物活性的損失[3]，且植物組織中葉黃素一般以晶體形式存在于有色體中，在消化道內(nèi)難以完全釋放，生物利用度較低[4]。

為克服上述缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇構(gòu)建一種平均粒徑在50～500 nm的水包油（O/W）納米乳液載運(yùn)體系，以期改善葉黃素的溶解性、穩(wěn)定性和生物活性，納米乳液一般由油相、水相、乳化劑和助乳化劑等成分組成，O/W型納米乳液可用來(lái)包埋類(lèi)胡蘿卜素[5]、功能性油脂、脂溶性維生素[6]和某些香精油[7]。且常見(jiàn)的蛋白質(zhì)（如β-乳球蛋白[8]、大豆分離蛋白[9]和豌豆蛋白[10]）、多糖（如變性淀粉[11]和果膠[12]）、磷脂（如卵磷脂[13]和大豆磷脂[14]）和某些美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[15]等，均可用作乳化劑構(gòu)建安全性較高的納米乳液。研究表明，納米乳液能夠改善活性成分的穩(wěn)定性、溶解性、分散性和生物利用度[16]，此外，選擇不同的油、水相及向其中添加不同的抗氧化劑或增稠劑等，可調(diào)控納米乳液的理化穩(wěn)定性[16]。因此，納米乳液是一種理想的活性成分載運(yùn)體系。

近年來(lái)，出現(xiàn)了許多利用乳液體系包埋葉黃素的報(bào)道，主要研究乳化劑類(lèi)型、貯存溫度和pH值等因素對(duì)乳液理化穩(wěn)定性的影響，如Weigel等[17]分別利用皂苷、吐溫-80、乳清蛋白和酪蛋白作乳化劑，比較發(fā)現(xiàn)皂苷穩(wěn)定的納米乳液具有良好的理化穩(wěn)定性；Gumus等[15]的研究表明與酪蛋白穩(wěn)定的納米乳液相比，葡聚糖和酪蛋白的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物作為乳化劑，顯著改善了乳液體系的理化穩(wěn)定性；Teo等[18]以乳清分離蛋白為乳化劑，通過(guò)乳化-溶劑蒸發(fā)法構(gòu)建葉黃素納米乳液，發(fā)現(xiàn)該乳液體系對(duì)Caco-2細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，且與傳統(tǒng)乳液相比，納米乳液中葉黃素的細(xì)胞攝取量更高。

因?yàn)槿~黃素是一種天然抗氧化劑，且其穩(wěn)定性和生理活性易受環(huán)境因素（如食品基質(zhì)和加工處理?xiàng)l件）的影響[19-20]；因此，本研究主要以自由基清除活性評(píng)價(jià)為目的，首先構(gòu)建一種葉黃素納米乳液體系，并評(píng)價(jià)其對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基的清除能力和氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），進(jìn)一步分析常見(jiàn)環(huán)境因素（pH值、熱處理、離子強(qiáng)度和濃縮）對(duì)乳液體系的葉黃素質(zhì)量濃度以及自由基清除活性的影響，以分析納米乳液載運(yùn)體系在多種條件下的葉黃素載運(yùn)有效性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉黃素（＞90%） 上海源葉生物科技有限公司；酪蛋白酸鈉（食品級(jí)） 麥克林生物試劑有限公司；玉米油購(gòu)自上海某超市；DPPH（＞97.0%）、ABTS（98%） 薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；水溶性VE（Trolox）（＞98%） 北京伊諾凱科技有限公司；2,2’-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH）（98%）、熒光素（fluorescein，F(xiàn)L）（＞95%）、過(guò)硫酸鉀（分析純） 上海泰坦科技股份有限公司；其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2000高壓均質(zhì)機(jī) 丹麥APV公司；omni納米粒度-Zeta電位儀 美國(guó)布魯克海文儀器公司；Polytron?PT高速剪切均質(zhì)機(jī) 瑞士Kinematica公司；U1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；R206B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；ENSPIRE 2300全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Perkin Elmer公司；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BILON-2000F冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；PL203電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葉黃素納米乳液的制備

將酪蛋白酸鈉粉末分散于去離子水中至質(zhì)量濃度為1.0 g/100 mL，4 ℃貯存過(guò)夜使之完全溶解；玉米油中加入過(guò)量葉黃素粉末，超聲10 min輔助分散，4 ℃避光貯存過(guò)夜使之溶解完全，3 000 r/min離心10 min，取上清即為葉黃素油溶液；將蛋白溶液與葉黃素油溶液按9∶1的質(zhì)量比混合，10 000 r/min 高速剪切2 min得粗乳液，將粗乳液于100 MPa下高壓均質(zhì)，循環(huán)7 次，得葉黃素納米乳液。所有樣品均貯存在4 ℃冰箱中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.3.2 葉黃素納米乳液粒徑和Zeta電位的測(cè)定

將乳液樣品用去離子水稀釋后，利用納米粒度-Zeta電位儀對(duì)乳液樣品的平均粒徑、粒徑分布（稀釋1 000倍）和Zeta電位（稀釋100 倍）進(jìn)行測(cè)定。所有樣品重復(fù)測(cè)定3 次，所有的測(cè)定在25 ℃下進(jìn)行。

1.3.3 環(huán)境因素設(shè)計(jì)

1.3.3.1 pH值

取新制葉黃素納米乳液，用1 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為2.0、6.0、8.0、10.0和12.0，再將乳液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃暫存，1 d內(nèi)取樣完成后續(xù)測(cè)定。

1.3.3.2 熱處理

取新制葉黃素納米乳液轉(zhuǎn)移至離心管中，分別于60、80 ℃和100 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，4 ℃暫存，1 d內(nèi)取樣完成后續(xù)測(cè)定。

1.3.3.3 離子強(qiáng)度

取新制葉黃素納米乳液，加入NaCl溶液調(diào)節(jié)乳液的離子強(qiáng)度為50、100 mmol/L，將乳液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃暫存，1 d內(nèi)取樣完成后續(xù)測(cè)定。

1.3.3.4 濃縮

取一定體積新制葉黃素納米乳液，設(shè)置水浴溫度為50 ℃，分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原乳液體積的1/5、2/5、3/5和4/5，將乳液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃暫存，1 d內(nèi)取樣完成后續(xù)測(cè)定。

1.3.4 葉黃素納米乳液自由基清除活性評(píng)價(jià)

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照Guan Yongguang等[21]的方法，并稍作修改。準(zhǔn)確配制0.1 mmol/L DPPH溶液，吸取100 μL乳液樣品與3 mL DPPH溶液混合均勻，暗處反應(yīng)20 min，再于5 000 r/min離心10 min，取上清液，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為Ai；吸取100 μL乳液樣品與3 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液混合反應(yīng)后，于相同條件下測(cè)定吸光度，記為Aj；吸取100 μL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液與3 mL DPPH溶液混合反應(yīng)后，于相同條件下測(cè)定吸光度，記為A0。按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.4.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的測(cè)定

參照Guan Yongguang等[21]的方法，并稍作修改。準(zhǔn)確配制7.0 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液，等體積混合暗處反應(yīng)12～16 h產(chǎn)生ABTS陽(yáng)離子自由基，用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液將上述混合溶液稀釋至734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.70±0.05左右。準(zhǔn)確吸取50 μL適當(dāng)稀釋的葉黃素納米乳液樣品與3 mL稀釋后的ABTS陽(yáng)離子溶液混合避光反應(yīng)6 min，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為At；吸取50 μL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液與3 mL稀釋后的ABTS陽(yáng)離子溶液混合避光反應(yīng)后，于相同條件下測(cè)定吸光度，記為A0。按式（2）計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。

1.3.4.3 ORAC的測(cè)定

參照Qian Bingjun等[22]的方法，并稍作修改。ORAC實(shí)驗(yàn)在pH 7.4的75 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中進(jìn)行，所有溶液均以該P(yáng)BS配制。

75 mmol/L PBS：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.21 g KH2PO4加入去離子水溶解定容至1 000 mL（A液），準(zhǔn)確稱(chēng)取13.06 g K2HPO4加入去離子水溶解定容至1 000 mL（B液），將800 mL B液與200 mL A液混合均勻，調(diào)節(jié)pH值為7.4，即為75 mmol/L PBS。

FL儲(chǔ)存液（70 μmol/L）：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.001 2 g FL，用75 mmol/L PBS溶解定容至100 mL，即為FL儲(chǔ)存液，-20 ℃避光冷凍保存。使用時(shí)稀釋至所需濃度。

AAPH溶液（120 mmol/L）：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.325 4 g AAPH，用75 mmol/L PBS溶解定容至10 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。

Trolox儲(chǔ)存液（100 μmol/L）：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5 mg Trolox，用75 mmol/L PBS溶解定容至100 mL，即為100 μmol/L的Trolox溶液，-20 ℃避光冷凍保存。使用時(shí)稀釋至所需濃度。

準(zhǔn)確吸取10 μL PBS、Trolox標(biāo)準(zhǔn)液（100、50、25、12.5、6.25 μmol/L）和樣品溶液（用75 mmol/L PBS稀釋1 000 倍體積）加入到黑色96 孔板中，37 ℃孵育10 min，向各孔中加入120 μL 70 nmol/L的FL溶液，37 ℃孵育30 min，之后迅速加入20 μL新制的120 mmol/L AAPH溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。設(shè)置酶標(biāo)儀參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm、反應(yīng)溫度37 ℃，每隔2 min測(cè)定一次各孔熒光強(qiáng)度，每次測(cè)定前低速振動(dòng)孔板5 s，共測(cè)定120 min。

在本次高速公路水泥混凝土路面施工中，采用三軸式攤鋪機(jī)，其具體的施工工藝流程為：制作、安裝模板→混凝土的拌和→混凝土的運(yùn)輸與攤鋪→滾動(dòng)、振動(dòng)及整平→養(yǎng)生[2]。

以相對(duì)熒光強(qiáng)度采用近似積分法計(jì)算熒光衰退曲線下面積（area under the curve，AUC）。實(shí)驗(yàn)各孔不同時(shí)間點(diǎn)的絕對(duì)熒光強(qiáng)度與初始熒光強(qiáng)度的比值為相對(duì)熒光強(qiáng)度（fi）。

式中：fn為第n個(gè)測(cè)定點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度；Δt為測(cè)定時(shí)間間隔2 min，則式（3）可簡(jiǎn)化為式（4）、（5）。

式中：Net AUC為凈熒光衰退AUC；AUCsample為樣品溶液AUC；AUC+AAPH為PBS與AAPH溶液混合后的AUC。

以Net AUC為縱坐標(biāo)，Trolox濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y＝0.806 3X+4.666 4；R2＝0.998 7），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的ORAC值，以每毫升溶液中Trolox的物質(zhì)的量表示。

1.3.5 葉黃素納米乳液中葉黃素質(zhì)量濃度的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取400 μL葉黃素納米乳液樣品，加入3 mL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，于460 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；以不含葉黃素的空白納米乳液為對(duì)照。同時(shí)，以DMSO為溶劑配制2.0～10.0 μg/mL系列質(zhì)量濃度的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.114 3x-0.018 4；R2＝0.999 3），將樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葉黃素質(zhì)量濃度[23]。

1.3.6 葉黃素納米乳液的FTIR分析

冷凍干燥后的葉黃素納米乳液與葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行FTIR分析。掃描次數(shù)32 次，分辨率為4 cm-1，掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 葉黃素納米乳液基本性質(zhì)和抗氧化活性

高壓均質(zhì)過(guò)程中，均質(zhì)腔內(nèi)產(chǎn)生高速剪切、空化和撞擊等破壞作用，打破油水界面[24]，兩親性的酪蛋白酸鈉分子可快速吸附在新形成的油水界面上，部分蛋白鏈和帶電氨基酸產(chǎn)生空間位阻和靜電斥力，穩(wěn)定葉黃素納米乳液[25]。由表1可知，葉黃素納米乳液的平均粒徑、多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）和Zeta電位分別為（223.77±2.40）nm、0.119±0.018和（-40.22±1.39）mV；葉黃素納米乳液的平均粒徑小于250 nm，PDI小于0.2，表明其粒徑分布較窄；乳滴攜帶的凈電位值大于30 mV，表明乳滴之間的靜電斥力足以維持乳液體系的物理穩(wěn)定[26]。

表1 葉黃素納米乳液基本性質(zhì)Table 1 Characteristics of lutein-enriched nanoemulsion

如表2所示，葉黃素納米乳液體系的DPPH、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率和ORAC分別為（26.91±2.45）%、（48.63±2.31）%和（48.69±2.25）μmol/mL，顯著大于空白納米乳液（不含葉黃素）和葉黃素油水混合物（未經(jīng)高壓均質(zhì)的粗乳液）以及葉黃素有機(jī)溶劑體系（溶劑為DMSO）（P＜0.05），表明納米乳液體系能夠顯著改善葉黃素的抗氧化活性。這可能與乳液體系的微結(jié)構(gòu)有關(guān)，一方面，乳化增加了葉黃素的分散性和溶解性，有助于葉黃素與自由基接觸反應(yīng)；另一方面，乳液粒徑較小，故界面比表面積增加，提高了葉黃素與自由基的接觸機(jī)率。

表2 葉黃素納米乳液的抗氧化活性Table 2 Free radical scavenging activity of nanoemulsion

2.2 環(huán)境因素對(duì)葉黃素納米乳液穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響

2.2.1 pH值對(duì)葉黃素納米乳液穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響

圖1 pH值對(duì)葉黃素納米乳液穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響Fig. 1 Lutein stability and radical scavenging capacity in nanoemulsion under different pHs

pH 2.0～12.0范圍內(nèi)葉黃素納米乳液中葉黃素質(zhì)量濃度的變化如圖1A所示。因酪蛋白酸鈉的等電點(diǎn)為pH 4.6，故調(diào)節(jié)乳液pH值為4.0左右時(shí)，靜電斥力不足以維持體系的穩(wěn)定，乳液很快分層失穩(wěn)，因此未能對(duì)其中的葉黃素質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定；當(dāng)調(diào)節(jié)乳液pH值為2.0后，與原乳液相比，其中的葉黃素質(zhì)量濃度有所減小（下降了9.30%），其余各pH值條件下納米乳液中的葉黃素質(zhì)量濃度均無(wú)顯著變化（P＜0.05）。以上結(jié)果表明酸性條件下葉黃素分子容易發(fā)生降解，之前的研究也表明類(lèi)胡蘿卜素分子暴露在酸性條件下，容易與氫離子形成離子對(duì)，并裂解生成類(lèi)胡蘿卜素碳正離子，進(jìn)而發(fā)生降解和異構(gòu)化[3,23]，故該納米乳液產(chǎn)品應(yīng)盡量避免在酸性食品中應(yīng)用。

由圖1B可知，在pH 2.0、6.0、8.0、10.0和12.0時(shí)葉黃素納米乳液的DPPH自由基清除率分別為（31.59±0.19）%、（25.45±1.36）%、（21.71±1.72）%、（19.75±1.76）%和（14.35±1.19）%，pH 2.0時(shí)的葉黃素納米乳液DPPH自由基清除能力顯著大于原乳液，pH 6.0～10.0范圍內(nèi)DPPH自由基清除率差異并不顯著（P＞0.05），當(dāng)pH值至12.0時(shí)，DPPH自由基清除能力顯著小于原乳液（P＜0.05），可能是乳液體系內(nèi)的H+濃度對(duì)抗氧化劑清除DPPH自由基的作用機(jī)制有一定影響。許申鴻等[27]研究表明，在pH 2～10之間，隨著介質(zhì)pH值的增大，特丁基對(duì)苯二酚清除DPPH自由基的效果有所下降；Singh等[28]利用DPPH法評(píng)價(jià)啤酒樣品的自由基清除活性，發(fā)現(xiàn)原樣品（pH 4.4）的DPPH自由基清除能力顯著大于pH 7.3的啤酒樣品。但是P?kal等[29]研究表明，H+濃度降低使得DPPH自由基與黃酮的反應(yīng)速率增大；Dawidowicz等[30]研究表明，與單純的甲醇溶劑相比，H+濃度增加可減緩DPPH自由基與抗氧化劑的反應(yīng)速率。不同類(lèi)型抗氧化劑與DPPH自由基反應(yīng)的具體機(jī)理存在一定差異[31]，故體系組成不同時(shí)，pH值造成的影響可能不同，具體原因有待進(jìn)一步探討。

由圖1B可知，在pH 2.0、6.0、8.0、10.0和12.0時(shí)葉黃素納米乳液的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率分別為（12.93±0.42）%、（48.54±1.19）%、（48.23±3.59）%、（50.99±3.60）%和（55.94±1.81）%，pH 6.0～8.0范圍內(nèi)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率與原乳液無(wú)顯著差異（P＞0.05），當(dāng)pH值為2.0時(shí)，葉黃素納米乳液的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力顯著減小（P＜0.05）。一方面因?yàn)榇藭r(shí)乳液體系內(nèi)葉黃素有所降解；另一方面，Dawidowicz等[32]認(rèn)為ABTS陽(yáng)離子反應(yīng)屬單電子或氫轉(zhuǎn)移機(jī)制，抗氧化劑的脫氫能力影響其抗氧化活性，在酸性pH值條件，由于質(zhì)子化作用，抗氧化劑如二叔丁基羥基甲苯清除ABTS陽(yáng)離子自由基的能力有所減小。一般pH值增大某些抗氧化劑給電子能力增加，可能加速ABTS陽(yáng)離子自由基清除反應(yīng)，故本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)pH值增加至10.0～12.0時(shí)，乳液的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力有所增加；Faria等[33]利用ABTS法評(píng)價(jià)肯氏蒲桃提取物的自由基清除活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著pH值的增加ABTS陽(yáng)離子自由基清除率呈增加的趨勢(shì)。

在pH 2.0、6.0、8.0、10.0和12.0時(shí)葉黃素納米乳液ORAC分別為（18.03±1.82）、（46.97±1.99）、（44.22±2.49）、（50.80±1.63）、（47.53±2.79）μmol/mL（圖1B），葉黃素納米乳液在酸性條件下的ORAC顯著減小（P＜0.05），其他pH值下并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），可能是酸性條件下葉黃素發(fā)生部分降解所致。

綜上所述，不同評(píng)價(jià)方法結(jié)果表明強(qiáng)酸及強(qiáng)堿條件對(duì)葉黃素納米乳液的抗氧化活性有不同程度的影響，故該乳液產(chǎn)品應(yīng)盡量在中性條件下貯存和應(yīng)用。

2.2.2 熱處理對(duì)葉黃素納米乳液穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響

類(lèi)胡蘿卜素分子內(nèi)含有多個(gè)共軛雙鍵，對(duì)熱處理較為敏感，如圖2A所示，與原乳液相比，60～100 ℃下水浴30 min后，葉黃素納米乳液中的葉黃素質(zhì)量濃度并未發(fā)生顯著變化（P＞0.05），僅在100 ℃熱處理后，乳液中的葉黃素降解量較大（8.35%），表明低溫短時(shí)熱處理對(duì)納米乳液體系中葉黃素質(zhì)量濃度的影響較?。贿@可能因?yàn)槿~黃素被包埋進(jìn)乳滴中，且乳液體系內(nèi)的酪蛋白酸鈉具有一定的抗氧化活性和熱穩(wěn)定性，改善了芯材對(duì)熱處理的抵抗能力，但是生產(chǎn)加工過(guò)程中該納米乳液體系應(yīng)避免在高溫條件的暴露。如圖2B所示，60、80 ℃和100 ℃水浴30 min后，葉黃素納米乳液的DPPH自由基清除能力顯著減?。≒＜0.05），ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力與原乳液相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。對(duì)于ORAC來(lái)說(shuō)，僅在100 ℃熱處理之后顯著減?。≒＜0.05）。3 種評(píng)價(jià)方法均表明低溫短時(shí)熱處理對(duì)乳液自由基清除活力的影響相對(duì)較小，一方面，因?yàn)槿橐后w系的保護(hù)增強(qiáng)了葉黃素的穩(wěn)定性，熱處理之后葉黃素的降解并不顯著；另一方面，乳液體系本身具有熱穩(wěn)定性，在熱處理過(guò)程中乳滴粒徑的顯微形態(tài)未受顯著影響[12]。

圖2 熱處理對(duì)葉黃素納米乳液穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響Fig. 2 Lutein stability and free radical scavenging capacity in nanoemulsion under thermal treatment

2.2.3 離子強(qiáng)度對(duì)葉黃素納米乳液穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響

圖3 離子強(qiáng)度對(duì)葉黃素納米乳液穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響Fig. 3 Lutein stability and free radical scavenging capacity in nanoemulsion under different ionic strengths

因前期實(shí)驗(yàn)（數(shù)據(jù)未發(fā)表）表明NaCl濃度大于100 mmol/L時(shí)，乳液在貯存期間容易失穩(wěn)，故選擇調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度為50 mmol/L和100 mmol/L。由圖3A可知，納米乳液體系內(nèi)葉黃素質(zhì)量濃度未發(fā)生顯著變化（P＞0.05），表明短時(shí)間內(nèi)在該離子強(qiáng)度范圍內(nèi)Na+對(duì)納米乳液中葉黃素質(zhì)量濃度無(wú)顯著影響。可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所用離子強(qiáng)度相對(duì)較小，且吸附于油水界面上的酪蛋白酸鈉作為抗氧化劑的同時(shí)，也作為界面屏障阻礙水相中的離子與葉黃素分子接觸，從而起到一定的保護(hù)作用[25]。

如圖3B所示，加NaCl溶液調(diào)節(jié)乳液的離子強(qiáng)度為50 mmol/L和100 mmol/L后，除ORAC外，其DPPH自由基清除率和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率均顯著小于原乳液（P＜0.05），但不同離子強(qiáng)度之間兩種自由基清除率不存在顯著差異（P＞0.05）。一方面，鹽離子的存在可能影響自由基清除反應(yīng)的速率。Dawidowicz等[32]研究表明ABTS陽(yáng)離子自由基能夠與某些金屬離子形成復(fù)合物，抑制ABTS陽(yáng)離子自由基與乳液體系內(nèi)抗氧化劑的反應(yīng)。P?kal等[29]研究表明，脫鹽處理后茶湯的DPPH自由基清除活力顯著增加。因?yàn)镈PPH自由基同樣能與某些金屬離子形成復(fù)合物，使得自由基清除反應(yīng)動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化[30]。顧敏等[34]研究表明鹽離子的存在可能影響FL的電離，改變FL的氧化速率，進(jìn)而使得測(cè)得的ORAC偏高。另一方面，陽(yáng)離子的加入使得納米乳滴攜帶的電位稍有減小，且粒徑有所增大，故與自由基接觸反應(yīng)的界面面積減小。

2.2.4 濃縮對(duì)葉黃素納米乳液穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響

利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)設(shè)備將新制葉黃素納米乳液分別濃縮至原體積的4/5、3/5、2/5和1/5，由圖4A可知，隨著濃縮程度的增加，乳液體系內(nèi)的水分被大量移除，故相同體積內(nèi)葉黃素質(zhì)量濃度顯著大于未經(jīng)濃縮處理的原乳液（P＜0.05），而濃縮至4/5和3/5時(shí)的乳液中葉黃素質(zhì)量濃度并無(wú)顯著差異（P＞0.05），可能是因?yàn)樾D(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮過(guò)程中伴隨攪動(dòng)和熱處理，導(dǎo)致葉黃素發(fā)生部分降解，抵消了濃縮帶來(lái)的濃度增加效應(yīng)。

如圖4B所示，隨著濃縮程度的增加，葉黃素納米乳液的自由基清除能力均顯著增大（P＜0.05），因?yàn)闈饪s后乳液體系內(nèi)的葉黃素質(zhì)量濃度及酪蛋白酸鈉濃度均顯著增大，且兩者均具有抗氧化活性，故自由基清除能力顯著增大。濃縮至原乳液體積的4/5、3/5之后，乳液體系自由基清除率相近，此時(shí)體系內(nèi)的葉黃素質(zhì)量濃度無(wú)顯著差異，因此推測(cè)自由基清除能力與體系內(nèi)的葉黃素質(zhì)量濃度具有一定的相關(guān)性。

圖4 濃縮對(duì)葉黃素納米乳液穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響Fig. 4 Lutein stability and free radical scavenging capacity in nanoemulsion under condensation treatment

2.3 葉黃素納米乳液的FTIR分析

凍干葉黃素納米乳液樣品與葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品粉末的FTIR譜圖如圖5所示。葉黃素納米乳液樣品未發(fā)生吸收峰位移和產(chǎn)生新的吸收峰，說(shuō)明乳化之后葉黃素與酪蛋白酸鈉未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，僅通過(guò)物理相互作用結(jié)合，可能有利于葉黃素在目標(biāo)位點(diǎn)的釋放。

圖5 葉黃素納米乳液及葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品的FTIR圖Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of lutein-enriched nanoemulsion and lutein

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用高壓均質(zhì)法以酪蛋白酸鈉為乳化劑構(gòu)建了一種葉黃素納米乳液，同時(shí)評(píng)價(jià)其自由基清除活性及ORAC，所得納米乳液的平均粒徑、PDI和Zeta電位分別為（223.77±2.40）nm、0.119±0.018和（-40.22±1.39）mV。結(jié)果表明，該納米乳液體系顯著改善了葉黃素的自由基清除活性和ORAC；pH值（6.0～12.0）、離子強(qiáng)度（50、100 mmol/L NaCl）和熱處理對(duì)體系中葉黃素穩(wěn)定性的影響均不顯著，僅當(dāng)pH值為2.0及100 ℃熱處理后葉黃素的降解量相對(duì)較大，且此時(shí)自由基清除活性及ORAC有不同程度的減??；而濃縮處理后納米乳液體系的葉黃素質(zhì)量濃度和抗氧化活性均顯著增大；加入NaCl溶液后乳液的抗氧化活性則有所減小。綜上，在食品工業(yè)中，應(yīng)盡量避免將該葉黃素納米乳液應(yīng)用在高溫、偏酸性和較高的離子強(qiáng)度條件下，以免造成葉黃素生理活性的損失，同時(shí)需進(jìn)一步研究如何改善納米乳液在生產(chǎn)加工過(guò)程中的穩(wěn)定性。