倪卓 朱進(jìn)普 何勇 劉楠

細(xì)胞生物相容性評價是生物材料臨床應(yīng)用前必須檢測的項(xiàng)目，材料作為外來物進(jìn)入生物體通常會引起分子、細(xì)胞、組織和器官等水平上的生物學(xué)效應(yīng)，目前的評價方法主要以細(xì)胞毒性試驗(yàn)法為主[1]。聚醚醚酮（polyether ether ketone，PEEK）物理和化學(xué)性能優(yōu)越，屬于醫(yī)療材料熱門材料，在聚醚醚酮主鏈引入磺酸基可制備用于改善材料界面兼容性的磺化聚醚醚酮（sulfonated polyether ether ketone，SPEEK）。羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）作為骨骼替代材料具有良好的生物相容性，PEEK/HA 復(fù)合材料可以結(jié)合兩者的優(yōu)點(diǎn)，制備力學(xué)性能、化學(xué)性能、生物性能更加優(yōu)良的生物骨科材料，在骨骼移植中具有較大的應(yīng)用前景。細(xì)胞毒性研究的重要內(nèi)容是材料對細(xì)胞氧化應(yīng)激作用的影響，測量細(xì)胞MDA 和ROS 水平高低可以間接表示氧化應(yīng)激作用強(qiáng)弱[2]。

本文通過測量PEEK、SPEEK、PEEK/HA、PEEK/SPEEK/HA 材料分別對成骨細(xì)胞MG-63 和成纖維細(xì)胞3T3 細(xì)胞周期及產(chǎn)生MDA、ROS 水平的影響，研究材料對成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)理的影響，并比較成骨細(xì)胞MG-63 和成纖維細(xì)胞3T3 在PEEK/SPEEK/30%HA材料上的生長形貌，評價PEEK/SPEEK/HA 生物材料對成骨細(xì)胞生物相容性，為深入研究PEEK/SPEEK/HA 生物材料提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA（本實(shí)驗(yàn)室制備），SPEEK 含量為0.1～0.5%;RPMI1640 培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），小牛血清（Hyclone 公司，美國），磷酸鹽緩沖劑（phosphate buffered saline，PBS，Hyclone 公司，美國），0.25%胰蛋白酶（蘇州碧云天），5 mg/mL 噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT，Sigma 公司，美國），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，Amresco 公司，美國），MG-63 細(xì)胞系（CRL-1427，上海生命科學(xué)院），U2OS 細(xì)胞系，3T3 細(xì)胞系，細(xì)胞周期檢測試劑盒（蘇州碧云天），微量MDA 檢測試劑盒（南京建成生物），ROS 檢測試劑盒（蘇州碧云天），無水乙醇（東江試劑），戊二醛（東江試劑）。高壓滅菌鍋（HV-50，HIRAYAMA 公司），酶聯(lián)檢測儀（Imark，Bio-Rad 公司，美國），倒置相差顯微鏡（X71，OLYMPUS 公司），紫外可見分光光度計(jì)（UV-2450，島津），掃描共聚焦顯微鏡（FV1000，OLYMPUS 公司），流式細(xì)胞儀（FACSCALIBUR，BD 公司，美國），熱場發(fā)射SEM（SU-70，日本日立）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料浸提液制備

PEEK/HA與PEEK/SPEEK/HA各組材料經(jīng)高壓滅菌后，按16 mg/mL 用RPMI1640 培養(yǎng)基配成懸浮液，恒溫箱保持37℃靜置48 h 后離心，存放在4℃冰箱備用。

1.2.2 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

將配制的成骨細(xì)胞MG-63、成纖維細(xì)胞3T3 的2×105個/mL細(xì)胞懸浮液分別滴加在12 孔板中模壓材料上培養(yǎng)24 h，取出材料用磷酸鹽緩沖劑清洗材料2 次，滴加胰蛋白酶并收集單細(xì)胞懸浮液于EP 管中，在2 000 rpm 左右離心儀中離心3～5min，吸棄上清液，加入1 mL 預(yù)冷的PBS，重新懸浮細(xì)胞，再次離心沉淀，小心吸除上清液，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。加入1 mL 冰浴預(yù)冷的70%乙醇中，輕輕吹打混勻，放入4℃冰箱靜置24 h 后，取出EP 管在2 000 rpm 左右離心儀中離心3～5 min，沉淀細(xì)胞，每管加入配制好的染色液0.5mL（按試劑盒要求配制），37℃避光溫浴30 min，采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測成骨細(xì)胞MG-63、成纖維細(xì)胞3T3 周期分布[3]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次（n=3）。

1.2.3 細(xì)胞氧化應(yīng)激性影響實(shí)驗(yàn)

將復(fù)合材料分別制成5 mm×2 mm 圓柱體模壓材料，經(jīng)過高溫高壓滅菌后加入到12 孔板中。將對數(shù)生長期的成骨細(xì)胞MG-63、成纖維細(xì)胞3T3 配制成2×105個/mL 細(xì)胞懸浮液，滴加在材料上培養(yǎng)，24 h 后從孔板中取出材料，先用磷酸鹽緩沖劑清洗材料，然后滴加0.5 mL 胰蛋白酶，消化并收集材料上培養(yǎng)的細(xì)胞。往收集細(xì)胞中加入終濃度為10 M/L 的活性氧ROS 熒光探針DCFH-DA（1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA）1 mL，放入培養(yǎng)箱中半小時，每隔4 min搖勻一次，設(shè)置培養(yǎng)條件溫度為37℃，CO2濃度為5%。探針和細(xì)胞充分作用后，未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA 用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌，滴加0.5 mL 胰蛋白酶完成細(xì)胞消化，收集細(xì)胞放入含血清的培養(yǎng)基終止消化。將消化完成的細(xì)胞放入1 200 rpm 離心儀離心5 min 后，吸出上清液，加入1 mL的PBS，再離心2～3 次并棄掉上清液，加入500 L PBS，掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量檢測，記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次（n=3）。

丙二醛（MDA）和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）反應(yīng)可產(chǎn)生紅色產(chǎn)物的顯色反應(yīng)，產(chǎn)物在535 nm 處有最大吸收值，因此可對細(xì)胞中MDA 進(jìn)行定量檢測[4]。分別取對數(shù)生長期成骨細(xì)胞MG-63、成纖維細(xì)胞3T3，配制成2×104個/mL 的細(xì)胞懸浮液，與經(jīng)滅菌的PEEK 模壓材料于12 孔板中培養(yǎng)12 h、24 h、36 h 后，取出材料，PBS 清洗材料2 次，用0.5 mL 胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集單細(xì)胞懸浮液于試管中，按照微量MDA 檢測試劑盒規(guī)范依次加入試劑，輕輕混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，放入95℃水?。ɑ蛴盟″侀_蓋煮沸）40 min，取出后流水冷卻，然后離心儀設(shè)置3 500～4 000 rpm 離心10 min，取上清液，設(shè)置紫外可見分光光度計(jì)測量波長535 nm，光徑1 cm，雙蒸水調(diào)零，測各樣品吸光度值[5]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次（n=3），MDA 含量用公式1 計(jì)算并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 材料表面細(xì)胞生長形貌觀察

將配制的成骨細(xì)胞MG-63、成纖維細(xì)胞3T3 的2×104個/mL細(xì)胞懸浮液分別滴加在12 孔板中模壓材料培養(yǎng)5 d 后（每天需換新鮮培養(yǎng)液），小心取出模壓材料，用磷酸鹽緩沖劑清洗材料2 次，放入試管中。往試管中加入2.5%戊二醛固定細(xì)胞3～4 h，用磷酸鹽緩沖劑洗滌3 次，吸起并棄掉戊二醛，按30%、50%、70%、85%、90%、100%乙醇濃度順序依次脫水15 min，其中100%無水乙醇重復(fù)脫水1～2 次，將試管置于真空冷凍干燥機(jī)中，隔夜取出試管固定并噴金鍍膜，使用掃描電鏡觀察2～3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算各組數(shù)據(jù)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本實(shí)驗(yàn)均數(shù)比較采用方差分析（ANOVA），P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料化學(xué)組成對成骨細(xì)胞MG-63 和成纖維細(xì)胞3T3 細(xì)胞分裂周期影響

碘化丙啶（propidium iodide，PI）可以和雙鏈DNA 結(jié)合產(chǎn)生熒光，雙鏈DNA 的含量越高，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。流式細(xì)胞儀可以對細(xì)胞進(jìn)行DNA 含量測定，利用碘化丙啶染色細(xì)胞DNA，然后測量細(xì)胞DNA 含量的不同分布進(jìn)行細(xì)胞周期分析[6]。

流式細(xì)胞術(shù)分析不同材料對成骨細(xì)胞MG-63 的周期影響見表1。PEEK 和SPEEK 材料作用于成骨細(xì)胞MG-63 后與對照組相比，G0/G1細(xì)胞比例增加，S 期細(xì)胞比例減少，表明兩種材料阻滯細(xì)胞增殖，降低了細(xì)胞增殖活性。與SPEEK材料相比，PEEK 材料組G0/G1細(xì)胞比例增加，S 期細(xì)胞比例減少，表明SPEEK 材料對細(xì)胞增殖抑制作用小于PEEK材料，對細(xì)胞周期阻滯作用相對較小，一定程度上能夠加快細(xì)胞增殖過程中G0/G1期向S 期的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞增殖。PEEK/HA 材料組相比PEEK 和SPEEK 材料G0/G1細(xì)胞比例減少，S 期細(xì)胞比例增加，隨著PEEK/HA 復(fù)合材料中HA含量增加，G0/G1細(xì)胞比例逐漸減少，細(xì)胞基本不再處于滯留期進(jìn)入細(xì)胞分裂，細(xì)胞增殖活性變強(qiáng)，直接表現(xiàn)為DNA分子合成旺盛的S 期和G2/M 期細(xì)胞所占比例增加。PEEK/SPEEK/HA 復(fù)合材料對細(xì)胞周期的影響與對照組相比，其中PEEK/SPEEK/10%HA 材料對細(xì)胞周期有一定阻滯作用，隨著HA 含量增加，阻滯作用逐漸減小，HA 為20%時，對細(xì)胞周期阻滯作用不明顯，G0/G1細(xì)胞比例逐漸減少，S 期細(xì)胞比例逐漸增加;當(dāng)HA 為30%時，成骨細(xì)胞MG-63 周期與對照組相數(shù)據(jù)接近，G0/G1細(xì)胞比例降低，G2/M 期細(xì)胞比例上升，加快了細(xì)胞周期進(jìn)程。

表1 成骨細(xì)胞MG-63 在材料上的細(xì)胞周期分布（）

表1 成骨細(xì)胞MG-63 在材料上的細(xì)胞周期分布（）

注:實(shí)驗(yàn)組分別為PEEK、SPEEK、PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA、PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA 在材料上培養(yǎng)24 h 后，采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測成骨細(xì)胞MG-63 周期過程細(xì)胞數(shù)量分布，對照組為模擬人體環(huán)境體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞MG-63 周期過程細(xì)胞數(shù)量分布。G0/G1期細(xì)胞數(shù)量反映細(xì)胞增殖狀況，S 期和G2/M 期細(xì)胞數(shù)量反映細(xì)胞增殖活躍程度。

流式細(xì)胞術(shù)分析不同材料對成纖維細(xì)胞3T3 的周期影響見表2。與對照組相比，PEEK 和SPEEK 材料中G0/G1期細(xì)胞較多，S 期細(xì)胞較少，說明有細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，細(xì)胞增殖活性降低。PEEK/HA 與PEEK/SPEEK/HA 材料組相比PEEK 和SPEEK 材料組，G0/G1細(xì)胞比例減少，S 期細(xì)胞比例增加，隨著HA 含量增加，G0/G1細(xì)胞比例逐漸減少，細(xì)胞由阻留期進(jìn)入DNA 合成期，S 期細(xì)胞比例增加，細(xì)胞周期加快。相比PEEK/HA 材料組，PEEK/SPEEK/HA 材料組G0/G1期細(xì)胞更少，S 和G2/M 期細(xì)胞比例增多，當(dāng)HA 含量達(dá)到30%時，細(xì)胞周期時間與對照組接近，S+G2/M 期細(xì)胞比例增加，細(xì)胞增殖較為活躍，對細(xì)胞增殖有一定促進(jìn)作用。

表2 成纖維細(xì)胞3T3 在材料上的細(xì)胞周期分布（）

表2 成纖維細(xì)胞3T3 在材料上的細(xì)胞周期分布（）

注:實(shí)驗(yàn)組分別為PEEK、SPEEK、PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA、PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA 在材料上培養(yǎng)24 h 后，采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測成纖維細(xì)胞3T3 周期過程細(xì)胞數(shù)量分布，對照組為模擬人體環(huán)境體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞3T3 周期過程細(xì)胞數(shù)量分布。

2.2 材料化學(xué)組成對成骨細(xì)胞MG-63 和成纖維細(xì)胞3T3 的ROS 水平影響

采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ROS 水平，材料上細(xì)胞ROS 相對含量用平均熒光強(qiáng)度表示，成骨細(xì)胞MG-63 的ROS 水平計(jì)算結(jié)果見表3，成纖維細(xì)胞3T3 的ROS 水平計(jì)算結(jié)果見表4。在PEEK 和SPEEK 材料上生長的成骨細(xì)胞MG-63 的ROS平均熒光強(qiáng)度比對照組分別提高了87.21%和82.13%，PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA 材料相比對照組分別增加70.43%、65.89%、48.60%，生物相容性差異相對明顯（P<0.05）。PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA 材料相比對照組分別增加52.62%、38.87%、2.81%，其中PEEK/SPEEK/HA 材料組數(shù)據(jù)相比于PEEK/HA 材料組更接近對照組，生物相容性差異相對不明顯（P>0.05）。PEEK/SPEEK/30%HA 上的成骨細(xì)胞MG-63 的ROS 水平已經(jīng)和正常細(xì)胞接近，該材料對細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用影響小。

表3 材料上成骨細(xì)胞MG-63 的ROS 平均熒光強(qiáng)度（）

注:實(shí)驗(yàn)組分別為PEEK、SPEEK、PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA、PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA 在材料上培養(yǎng)24 h 后，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ROS 水平，對照組為模擬人體環(huán)境體外培養(yǎng)的細(xì)胞ROS水平，與對照組比較*P<0.05，**P>0.05。

在PEEK和SPEEK材料上生長的成纖維細(xì)胞3T3 的ROS平均熒光強(qiáng)度比對照組分別提高了 59.69%和 57.66%，PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA 材料相比對照組分別增加39.92%、26.45%、19.19%，PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA 材料相比對照組分別增加36.82%、20.06%、3.00%，PEEK 和SPEEK 材料上成纖維細(xì)胞3T3 的ROS 均高于對照組，其中SPEEK 材料中細(xì)胞產(chǎn)生ROS 相對較少，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平減弱。在PEEK/HA 和PEEK/SPEEK/HA 材料中，細(xì)胞ROS 水平隨HA 組分增加而降低，并且低于PEEK 和SPEEK 組，其中PEEK/SPEEK/HA 材料上細(xì)胞ROS 水平低于PEEK/HA 材料，PEEK/SPEEK/30%HA 與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 材料上成纖維細(xì)胞3T3 的ROS 平均熒光強(qiáng)度（）

表4 材料上成纖維細(xì)胞3T3 的ROS 平均熒光強(qiáng)度（）

注:實(shí)驗(yàn)組分別為PEEK、SPEEK、PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA、PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA 在材料上培養(yǎng)24 h 后，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ROS 水平，對照組為模擬人體環(huán)境體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞3T3 的ROS 水平，與對照組比較*P<0.05，**P>0.05。

2.3 材料化學(xué)組成對成骨細(xì)胞MG-63 和成纖維細(xì)胞3T3 MDA 水平影響

采用紫外可見分光光度計(jì)測量的PEEK、SPEEK、PEEK/HA、PEEK/SPEEK/HA 材料對成骨細(xì)胞MG-63 和成纖維細(xì)胞3T3 水平影響數(shù)據(jù)見表5。在12 h條件下，PEEK與SPEEK組分材料上成骨細(xì)胞MG-63 產(chǎn)生MDA 水平與對照組相比分別增加70.09%、59.65%，PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA 材料相比對照組分別增加33.81%、26.55%、22.83%，PEEK/SPEEK/10% HA、PEEK/SPEEK/20% HA、PEEK/SPEEK/30%HA 材料相比對照組分別增加30.09%、15.58%、8.32%，PEEK/HA、PEEK/SPEEK/HA 材料組隨著HA 質(zhì)量百分比增加，成骨細(xì)胞MG-63 的MDA 水平逐漸減少，其中PEEK/SPEEK/HA 材料組數(shù)據(jù)更接近對照組，生物相容性差異相對不明顯（P>0.05）。在24 h 條件下，對照組MDA 水平相比于12 h 條件下增加66.65%，PEEK 與SPEEK組分材料相比于12 h 分別增加3.75%和8.65%，PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA 材料相比于12 h 分別增加29.37%、33.99%、39.19%，PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA 材料相比于12 h 分別增加32.24%、46.24%、55.07%。PEEK 與SPEEK 組分材料上的成骨細(xì)胞MG-63 存在氧化應(yīng)激作用，對細(xì)胞增殖活力有抑制作用[7]，24 h 條件下細(xì)胞增殖活性受到抑制，MDA含量變化不大，細(xì)胞增殖量較少（P>0.05），這和細(xì)胞周期測試結(jié)果相符合;成骨細(xì)胞的增殖周期一般為20～24 h[8]，在36 h 條件下第二次增殖未完成，因此各組材料MDA 含量變化不大，表明細(xì)胞增殖會對MDA 含量變化產(chǎn)生影響，研究細(xì)胞的MDA 水平變化可反映細(xì)胞的增殖活性。

表5 材料上成骨細(xì)胞MG-63 的MDA 水平（）

表5 材料上成骨細(xì)胞MG-63 的MDA 水平（）

注:實(shí)驗(yàn)組分別為PEEK、SPEEK、PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA、PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA 在材料上培養(yǎng)12 h、24 h、36 h 后，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞MDA 水平，對照組為模擬人體環(huán)境體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞MG-63 的MDA 水平。

采用紫外可見分光光度計(jì)測量的PEEK、SPEEK、PEEK/HA、PEEK/SPEEK/HA 材料對成纖維細(xì)胞3T3 MDA 水平影響數(shù)據(jù)見表6，在48 h 條件下，PEEK 與SPEEK 組分材料上成纖維細(xì)胞3T3 產(chǎn)生MDA 水平與對照組相比分別增加214.29%、232.65%，PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA 材料相比對照組分別增加177.55%、122.49%、69.38%，PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA 材料相比對照組分別增加138.78%、85.71%、67.35%，從PEEK 與SPEEK 材料對成纖維細(xì)胞3T3 的細(xì)胞周期影響看，部分細(xì)胞處于G0/G1期被阻滯，無法進(jìn)入S 期進(jìn)行下一步分裂，此時細(xì)胞MDA 遠(yuǎn)高于對照組，細(xì)胞存在氧化應(yīng)激作用作用，所以MDA 含量過高和細(xì)胞分裂活性受到抑制有關(guān)聯(lián);PEEK/HA 和PEEK/SPEEK/HA 材料中的HA可促進(jìn)DNA 合成，使G0/G1期向S 期轉(zhuǎn)化進(jìn)入分裂期從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，加快細(xì)胞周期。隨著PEEK/HA 和PEEK/SPEEK/HA 材料中的HA 質(zhì)量占比的增加，MDA 水平逐漸減少，PEEK/SPEEK/HA 材料各組數(shù)據(jù)相對較小。在72 h 條件下，PEEK 與SPEEK 材料上成纖維細(xì)胞3T3 產(chǎn)生的MDA 水平明顯高于對照組，細(xì)胞存在氧化應(yīng)激作用，細(xì)胞活性受到抑制;PEEK/HA 和PEEK/SPEEK/HA 材料組上成纖維細(xì)胞3T3 產(chǎn)生的MDA 水平相比于PEEK 與SPEEK 材料明顯降低，細(xì)胞活性得到改善，氧化應(yīng)激作用相對減弱，其中PEEK/30%HA 和PEEK/SPEEK/30%HA 材料上成纖維細(xì)胞3T3 產(chǎn)生的MDA 水平和對照組接近，從材料對細(xì)胞周期影響結(jié)果分析，細(xì)胞分裂周期正常，能夠完成分裂，說明細(xì)胞氧化應(yīng)激作用恢復(fù)正常，材料對細(xì)胞毒性影響減弱。

表6 材料上成纖維細(xì)胞3T3 的MDA 水平（）

表6 材料上成纖維細(xì)胞3T3 的MDA 水平（）

注:實(shí)驗(yàn)組分別為PEEK、SPEEK、PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA、PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA 在材料上培養(yǎng)48 h、72 h 后，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞MDA 水平，對照組為模擬人體環(huán)境體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞3T3 的MDA 水平。

2.4 PEEK/SPEEK/30%HA 上成骨細(xì)胞MG-63 與成纖維細(xì)胞3T3 微觀形態(tài)比較

通過生物制樣技術(shù)[9]可以觀察研究成骨細(xì)胞MG-63 與成纖維細(xì)胞3T3 在PEEK/SPEEK/30%HA材料縫隙中的生長形態(tài)。成骨細(xì)胞MG-63 與成纖維細(xì)胞3T3 在PEEK/SPEEK/HA 材料表面生物學(xué)粘附過程主要包括以下特征:細(xì)胞吸附—細(xì)胞接觸—附著—伸展4 個階段進(jìn)行，在圖1 中成骨細(xì)胞MG-63 與成纖維細(xì)胞3T3 吸附在材料凹陷位置生長，與材料表面接觸良好;圖2 顯示兩種細(xì)胞附著在材料縫隙處，呈三角形或長梭形，細(xì)胞偽足伸展?fàn)顟B(tài)良好，形態(tài)正常，表明該材料的微孔結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供了良好的附著點(diǎn);圖3 顯示兩種細(xì)胞已經(jīng)長出板層偽足及絲狀偽足緊密附著在材料表面，細(xì)胞呈現(xiàn)出扁平的形態(tài)，細(xì)胞偽足伸展到材料縫隙之間，表明細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)良好;圖4 顯示部分細(xì)胞板層偽足及絲狀偽足深入進(jìn)材料縫隙內(nèi)，成片的細(xì)胞在縫隙內(nèi)生長，表明PEEK/HA 復(fù)合材料的多孔結(jié)構(gòu)為MG-63 細(xì)胞與3T3 細(xì)胞的增殖提供了理想場所。

圖1 細(xì)胞在材料凹陷位置附著生長

圖2 細(xì)胞為長梭形，偽足伸展良好

圖4 細(xì)胞深入進(jìn)材料縫隙間生長

3 討論

研究表明，SPEEK 加入后，PEEK/SPEEK/HA 材料對細(xì)胞的生長、增殖、粘附、形態(tài)、凋亡等[10-11]方面具有良性作用，生物相容性得到提高，所以細(xì)胞的成骨作用沒有發(fā)生改變。不同材料對成骨細(xì)胞MG-63 與成纖維細(xì)胞3T3 分裂周期影響結(jié)果相似，三元復(fù)合材料對細(xì)胞周期的影響較低，加入HA 組分改善了材料生物相容性，促進(jìn)DNA 合成，說明調(diào)整HA 含量可以降低材料毒性[12]，較高HA 含量的三元復(fù)合材料中細(xì)胞增殖活躍，細(xì)胞周期加快，引入SPEEK一定程度可加快細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖。

材料化學(xué)組成對成骨細(xì)胞MG-63、成纖維細(xì)胞3T3 的MDA 和ROS 水平影響趨勢相同，細(xì)胞氧化應(yīng)激作用過強(qiáng)是細(xì)胞抵御外來物質(zhì)的一種方法，組分材料PEEK 和SPEEK生物相容性低于對照組，為了降解材料，機(jī)體釋放蛋白水解酶和活性氧類以侵蝕材料表面[13]，高濃度ROS 導(dǎo)致MDA含量上升，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄抑制、增殖減慢，促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡;在PEEK/HA 材料組上生長的兩組細(xì)胞ROS 平均熒光強(qiáng)度隨HA質(zhì)量占比增加逐漸降低，說明HA組分可降低PEEK材料對細(xì)胞的氧化損傷;PEEK/SPEEK/HA 材料數(shù)據(jù)結(jié)果和對照組接近，說明SPEEK 成分一定程度上降低了材料毒性。兩組數(shù)據(jù)中PEEK 和SPEEK 材料細(xì)胞的MDA 含量與對照組數(shù)據(jù)差異較大，生物相容性不如PEEK/HA、PEEK/SPEEK/HA 材料組。PEEK/HA、PEEK/SPEEK/HA 材料組中HA 組分可明顯降低PEEK 對細(xì)胞的氧化損傷，其中PEEK/SPEEK/HA 材料組數(shù)據(jù)更接近對照組，SPEEK 可改善成骨細(xì)胞MG-63 氧化應(yīng)激作用，改善材料生物相容性。

PEEK 材料經(jīng)過HA 和SPEEK 復(fù)合改性后，不僅可以提高表面粗糙度，還可以增加表面活性基團(tuán)，為生物學(xué)粘附提供良好的微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)粘附和增殖，提高生物相容性。SPEEK 本身結(jié)構(gòu)與PEEK 類似，能夠與PEEK 有效增容，所以PEEK/SPEEK/HA 材料保持原PEEK/HA 材料具備生物材料性質(zhì)的前提下，生物相容性進(jìn)一步得到提升。過高的HA含量將會增加材料的脆性，同時引入磺酸基使其能夠吸附羥基磷灰石粒子，形成化學(xué)鍵合，可提高二者界面的化學(xué)結(jié)合力，一定程度上能夠改善材料的脆性問題，對材料強(qiáng)度和韌性影響相對較小。

PEEK/SPEEK/30%HA 材料與成骨細(xì)胞MG-63 的生物相容性相比于PEEK 材料得到提高，一方面是人體骨骼組成的無機(jī)成分羥基磷灰石的加入，生物相容性也得到提高，另一方面是PEEK 主鏈上磺化聚醚醚酮的引入，改善了原材料的脆性問題，材料力學(xué)性能得到提高，為細(xì)胞的生物學(xué)粘附提供良好的微結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)粘附和增殖，提高生物相容性。

4 結(jié)論

PEEK/HA 生物材料與成骨細(xì)胞MG-63 和成纖維細(xì)胞3T3 生物相容性良好，對兩種細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用影響基本相似，細(xì)胞氧化應(yīng)激效應(yīng)隨生物材料PEEK/HA 中HA 質(zhì)量百分比的增加而減弱。在PEEK/HA 生物材料中引入磺酸基后，材料對兩種細(xì)胞氧化應(yīng)激效應(yīng)基本和模擬人體環(huán)境對照組接近，對細(xì)胞氧化損傷作用不明顯。PEEK 材料經(jīng)過HA和SPEEK 復(fù)合改性后得到的PEEK/SPEEK/HA 材料，表面粗糙度能達(dá)到細(xì)胞正常生長需求，表面活性基團(tuán)磺酸基能為細(xì)胞生物學(xué)粘附提供良好的微觀結(jié)構(gòu)，能促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖，提高PEEK/HA 材料生物相容性。PEEK/SPEEK/HA 材料具有類骨的微孔結(jié)構(gòu)，成骨細(xì)胞MG-63 和成纖維細(xì)胞3T3在該材料凹陷、縫隙、表面、縫隙內(nèi)都接觸良好，形態(tài)正常，生長正常不受到限制。