李克強(qiáng)，王 韌，馮 偉，羅小虎，王 莉，李 娟，李亞男，陳正行

（糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

大米作為全球超過30億人口的主糧，是食用人群最廣的三大谷物品種之一。然而，在中國、印度、泰國和日本等地區(qū)，隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和工業(yè)的迅速發(fā)展，濫用農(nóng)藥化肥、采礦等人類活動引起的鎘、鉛、砷、汞等重金屬污染已經(jīng)嚴(yán)重影響到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康。在中國，超過1.30×105km2的農(nóng)業(yè)土壤受到鎘污染，每年超過1.46×108kg農(nóng)產(chǎn)品受到鎘污染[1]。中國糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定大米中重金屬鎘的限量為0.20 mg/kg，而國內(nèi)市場上銷售大米重金屬鎘超標(biāo)率高達(dá)10%[2]，存在嚴(yán)重的食品安全隱患。毒理學(xué)研究表明鎘元素是一種生物蓄積性強(qiáng)、毒性持久、具有“三致”作用的劇毒元素。重金屬鎘的過量攝入會引起腎臟、肝臟、肺部、骨骼、生殖器官的損傷，對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等具有毒性效應(yīng)[3]，進(jìn)而引發(fā)多種疾病，如痛痛病等[4]。

隨著鎘污染大米問題日趨嚴(yán)重，國內(nèi)外有關(guān)鎘超標(biāo)大米中鎘消減的研究已有一些報(bào)道[5-7]。劉晶等[8]研究表明大米浸泡過程中重金屬發(fā)生了遷移。許艷霞等[9]采用檸檬酸和氯化鈉作為混合溶劑浸泡大米，結(jié)果表明檸檬酸濃度和浸提時(shí)間能顯著影響大米的除鎘率，最佳條件下的大米除鎘率達(dá)到82.20%。劉也嘉等[10]研究了乳酸菌發(fā)酵對大米重金屬鎘的脫除效果，優(yōu)化條件下的降鎘率約為79.24%。不少學(xué)者研究了鎘在稻米中的分布和存在狀態(tài)，其中查燕等[11]通過物理剝離的方法研究鎘在稻谷中的分布，結(jié)果顯示，鎘在以皮層和胚為主的糠層中含量最高，穎殼中最低，這與LIU等[12]的研究結(jié)果一致。田陽等[13]、楊居榮等[14-15]的研究結(jié)果同樣證明了稻谷中鎘的分布具有不均勻性，適當(dāng)提高碾米精度可降低大米的鎘含量，而精米中鎘主要富集在蛋白中，淀粉中積累較少。魏帥等[16]研究發(fā)現(xiàn)稻米蛋白中鎘含量與蛋氨酸和半胱氨酸呈顯著正相關(guān)關(guān)系?？梢?，鎘可能主要與蛋白中的巰基形成絡(luò)合物并穩(wěn)定存在大米胚乳中[17]?；谥亟饘冁k主要富集在大米蛋白中，陳露等[17]采用檸檬酸洗滌分離得到的大米蛋白，能夠去除大部分鎘。綜上所述，目前大多數(shù)除鎘方法要求將大米粉碎，以米粉的形式進(jìn)行除鎘處理[18]，而米粉喪失了整米可蒸煮食用的功能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鎘超標(biāo)早秈米：湖南糧食集團(tuán)提供，其鎘含量及主要理化指標(biāo)如表1所示；鹽酸、氫氧化鈉等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 鎘超標(biāo)早秈米主要理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of Cd-contaminated indica rice

恒溫水浴鍋：江蘇省金臺市榮華儀器制造有限公司；pH計(jì)：sartorius PB-10，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；微波消解爐：WX-6000，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；陽極溶出伏安法檢測重金屬儀器：HM-3000P，江蘇天瑞儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 整米除鎘反應(yīng) 準(zhǔn)確稱取20.00 g大米于250 mL具塞錐形瓶內(nèi)，將0.06 mol/L的鹽酸溶液置于30℃的水浴鍋內(nèi)預(yù)熱后，以1∶1的料液比加入到錐形瓶內(nèi)，搖勻保證大米與酸浸泡液充分接觸，將錐形瓶置于上述水浴鍋內(nèi)靜置反應(yīng)120 min。棄去浸泡液，向錐形瓶內(nèi)加入去離子水浸泡，促進(jìn)米粒中的鹽酸溶出，并用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)米水混合體系的pH為7.0，中和后大米用去離子水洗滌3次，瀝水，置于溫度為28℃，濕度為70%的恒溫恒濕箱緩慢干燥8 h，樣品留待鎘含量測定。

1.2.2 鎘的測定 將大米樣品粉碎并過80目篩。樣品消解采用微波消解：稱取過80目篩的干樣品粉末0.3～0.5 g（精確至0.000 1 g）放入微波消解罐中，加5 mL硝酸和2 mL過氧化氫。微波消解程序如下：第一階段，溫度100℃，時(shí)間1 min，壓力1.5×106Pa；第二階段，溫度 120℃，時(shí)間 1 min，壓力2.5×106Pa；第三階段，溫度 160 ℃，時(shí)間 2 min，壓力3.0×106Pa；第四階段，溫度 190 ℃，時(shí)間 12 min，壓力3.5×106Pa；消解完畢后，將消解物定容至10 mL。

陽極溶出伏安法測定鎘含量[19]：1）電極預(yù)處理。檢測鎘使用鍍汞膜玻碳電極。分別在砂紙和絨布上打磨拋光清洗玻碳電極后放入超純水浸泡5 min；并向參比電極內(nèi)管灌入3 mol/L的KCl溶液；鉑對電極用超純水沖洗。將以上3種電極分別插入裝置的相應(yīng)位置。2）電極維護(hù)階段。將鍍汞液倒入“維護(hù)液”分析杯，進(jìn)行鍍汞膜操作。3）制備空白樣、標(biāo)準(zhǔn)樣及待測樣。依次制備空白樣 （10 mL超純水＋10 mL電解液）、標(biāo)準(zhǔn)樣 （50 μL鎘標(biāo)樣＋10 mL超純水）、待測樣（10 mL 待測樣＋10 mL 電解液）。4）儀器校準(zhǔn)。選擇待測金屬（鎘）及量程檔，依次測定空白樣、標(biāo)準(zhǔn)樣校準(zhǔn)儀器后，開始測定待測樣。大米的除鎘率可按式（1）計(jì)算

式中：C0為原料大米初始鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù) （mg/kg，干基）；C1為除鎘后大米最終鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù) （mg/kg，干基）。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定 參照《GB 50095—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[20]。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 在上述除鎘反應(yīng)中，保持其他反應(yīng)條件不變，分別改變鹽酸濃度（0.02、0.04、0.06、0.08 和 0.12 mol/L）、溫度（30、35、40 和 45 ℃）、料液比 （1∶1、1∶2、1∶3 和 1∶4）、 浸提時(shí)間（10、20、40、60、120和240 min），考察各因素對大米除鎘率和蛋白質(zhì)含量的影響。

其中T2=1.73×σk，σk為鄰域內(nèi)方差[5]。T2的作用在于將噪聲分類，若判斷為高斯噪聲采用均值濾波，判斷為脈沖噪聲則用中值濾波。閾值T1的選取是針對圖像出現(xiàn)類似只有一個(gè)象素寬的細(xì)微紋理。T1一般取6～10之間的整數(shù)，本文中取8。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 采用響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化除鎘工藝，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇大米除鎘率為響應(yīng)值R，酸濃度、浸提時(shí)間、液固比、浸提溫度為影響因素。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 因素水平設(shè)計(jì)表Table 2 Design of factors and levels

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次平行結(jié)果的平均值。采用origin 8.6作圖，SPSS 21.0進(jìn)行ANOVA方差分析，并采用Design Expert 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 浸提時(shí)間對大米除鎘率和蛋白質(zhì)含量的影響

圖1結(jié)果顯示，隨著浸提時(shí)間的延長，除鎘率呈現(xiàn)先顯著增加后趨于平緩的趨勢。浸提120 min時(shí)的除鎘率顯著增大，繼續(xù)延長浸提時(shí)間，除鎘率變化不明顯，且除鎘率與蛋白質(zhì)損失呈顯著正相關(guān)，這與傅亞平等[21]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。鹽酸溶液中的游離H+作用于鎘與大米蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，與Cd2+形成競爭吸附，從而達(dá)到脫除重金屬鎘的效果。鎘溶出時(shí)間包括H+進(jìn)入米粒內(nèi)部及Cd2+游離到浸泡液中的傳質(zhì)時(shí)間。根據(jù)傳質(zhì)動力學(xué)分析，在不同溫度及酸濃度條件下，鎘解離平衡所需要的時(shí)間也有所不同，升高溫度并增加酸濃度能明顯增大傳質(zhì)動力，縮短浸提平衡時(shí)間[7]。而在0.06 mol/L的鹽酸溶液，反應(yīng)溫度30℃的實(shí)驗(yàn)條件下，結(jié)果顯示米粒的除鎘率在120 min達(dá)到最大值54.30%。因此，選定120 min作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最適浸提時(shí)間。

圖1 浸提時(shí)間對大米除鎘率和蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on Cadmium removal efficiency and concentration of rice protein

2.2 料液比對大米除鎘率和蛋白質(zhì)含量的影響

在45℃恒溫水浴浸提120 min，考察料液比對大米除鎘率的影響。從圖2中可以看出，隨著料液比增大至 1∶2，大米除鎘率顯著增大（P＜0.05）并逐漸趨于平緩。其中，料液比為1∶4條件下大米除鎘率達(dá)到71.72%，除鎘率變化不顯著（P＞0.05）。增大料液比能夠保證酸液與米粒充分接觸，鎘溶出量增大，但料液比在 1∶2～1∶4 范圍內(nèi)，除鎘率無顯著差異，表明料液比在此范圍內(nèi)對大米除鎘率無顯著影響，這與許艷霞等[9]研究結(jié)果一致。而蛋白損失由6.44%升高至10.61%，說明氫離子水解部分蛋白質(zhì)，造成蛋白損失增大。因此0.06 mol/L的鹽酸溶液，在料液比1∶2條件下能夠滿足鎘的溶出要求，且控制溶劑用量，因此選定料液比為1∶2。

圖2 料液比對大米除鎘率和蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of solid-solvent ratio on Cadmium removal efficiency and concentration of rice protein

2.3 溫度對大米除鎘率和蛋白質(zhì)含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3顯示，在鹽酸濃度為0.06 mol/L，料液比1∶2條件下，隨著浸泡溫度的升高，除鎘率逐漸提高，殘留鎘含量降至0.2 mg/kg左右。因?yàn)樯邷囟饶軌蛟龃髠髻|(zhì)動力，引起部分大米蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得鎘與蛋白結(jié)合位點(diǎn)暴露于質(zhì)子環(huán)境中，促進(jìn)了酸性條件下鎘離子的溶出。這與Veeken等[22]認(rèn)為在較高溫度下金屬離子具有更高的擴(kuò)散系數(shù)和提取率相一致。

此外，由圖3可知，在25～50℃范圍內(nèi)，隨著浸提溫度升高，大米的蛋白質(zhì)含量由7.96%降低至6.56%，溫度對大米蛋白質(zhì)的損失影響顯著 （P＜0.05）?？紤]加工能耗及減少蛋白質(zhì)損失，選定溫度45℃較適宜。

圖3 浸提溫度對大米除鎘率和蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of temperature on Cadmium removal efficiency and concentration of rice protein

2.4 鹽酸濃度對大米除鎘率和蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4（a）可以看出，鹽酸濃度對大米鎘消減影響極為顯著（P＜0.05）。隨著鹽酸濃度的不斷增大，鎘含量明顯降低，除鎘率顯著上升，可見酸對大米中鎘的溶出具有明顯促進(jìn)作用。部分學(xué)者同樣認(rèn)為[7，21]，酸法消減大米中重金屬鎘過程中，鎘的溶出效果主要是酸中氫離子的作用。

鹽酸濃度對大米蛋白質(zhì)含量的影響結(jié)果如圖4（b）所示。隨著鹽酸濃度增大，蛋白溶解損失先增加后趨于平緩。當(dāng)鹽酸濃度由0.02增大至0.06 mol/L時(shí)，蛋白質(zhì)含量由8.14%降低至7.25%，除鎘率從31.66%增加至 65.83%，變化顯著（P＜0.05）；當(dāng)鹽酸濃度大于0.06 mol/L時(shí)，除鎘率從65.83%增加至77.51%，變化顯著（P＜0.05）（圖 4（a）），蛋白質(zhì)含量變化不顯著（P＞0.05），這可能在于隨著易酸水解的蛋白溶解后，高濃度鹽酸溶液難以溶解不易酸解的蛋白，從而造成蛋白質(zhì)溶解損失變得平緩。這可以得出鹽酸溶液與大米反應(yīng)過程中，部分二硫鍵被破壞，肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起部分蛋白易溶于水[20]。而鎘的溶出一部分是隨蛋白一同水解溶出，另一部分是因?yàn)殒k離子與蛋白結(jié)合被打斷，鎘離子解離至鹽酸溶液中而洗脫。因此考慮到鹽酸濃度對大米品質(zhì)的影響，控制鹽酸濃度在0.12 mol/L左右為宜。

圖4 鹽酸濃度對大米除鎘率及大米蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of HCl concentration on Cadmium removal efficiency and concentration of rice protein

2.5 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

2.5.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在對大米中重金屬鎘脫除率的單因素實(shí)驗(yàn)分析基礎(chǔ)上，以除鎘率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化大米除鎘工藝條件，利用軟件Design-Expert 8.0對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Result and design of Box-Behnken experiments

方差分析結(jié)果見表4。從表4可知，模擬項(xiàng)P值小于0.05，表明模擬項(xiàng)顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。R2=0.948 2表明數(shù)值方程對實(shí)驗(yàn)具有良好的擬合效果，自變量與響應(yīng)值呈顯著相關(guān)性，可充分反映各因素之間的關(guān)系并用此模型對酸浸泡大米脫除重金屬鎘的脫除效率進(jìn)行預(yù)測。由F值檢驗(yàn)可以得到各因子的影響顯著水平為：A＞C＞D＞B，即鹽酸濃度＞料液比＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間。一次項(xiàng)A、C、D及二次項(xiàng)AC、A2對除鎘率的影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B及二次項(xiàng)C2影響顯著 （P＜0.05），其余項(xiàng)均不顯著（P＞0.05）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立的數(shù)值模型方程為：R=84.45+6.68A+1.75B+4.63C+2.46D-1.02AB-4.33AC-0.84AD+0.53BC-0.41BD+0.15CD-4.97A2+0.96B2-2.46C2-1.09D2。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.5.2 響應(yīng)曲面圖分析 鹽酸濃度、反應(yīng)時(shí)間、液固比以及反應(yīng)溫度之間的交互作用對大米除鎘率的影響見圖5。響應(yīng)面的形狀直觀反映了各因素對大米除鎘率的影響，曲面曲度越大，該因素對大米除鎘率的影響越顯著。 由圖 5（a～f）可知，AB、AC、AD對大米除鎘率的影響較為顯著，即酸濃度與時(shí)間、酸濃度與液固比、酸濃度與溫度對大米中重金屬鎘的脫除率影響較為顯著。此外，等高線的形狀可以反映因素間的交互作用是否明顯。圖中顯示AD因素間交互作用較為明顯。

2.5.3 最佳工藝條件的驗(yàn)證 使用Design-Expert 8.0.6.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到模型的最優(yōu)工藝參數(shù)和預(yù)測值：鹽酸濃度0.12 mol/L，時(shí)間120 min，料液比1∶2，溫度45℃，預(yù)測此條件下的除鎘率為90.97%。根據(jù)實(shí)際操作要求，選定除鎘條件為鹽酸濃度 0.12 mol/L，時(shí)間 120 min，料液比 1∶2，溫度45℃。最優(yōu)條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，所得到的大米鎘消減率的平均值為87.21%，此條件下所得到的大米除鎘率為預(yù)測值的95.86%，與回歸方程估計(jì)值吻合良好，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的除鎘條件可用。

圖5 兩因素交互作用對大米除鎘率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Effect of interactions between two factors on response surface of cadmium removal efficiency

3 結(jié)語

本研究選出鹽酸濃度、料液比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等4種顯著影響大米除鎘率和蛋白質(zhì)含量的因素，采用單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出最佳大米除鎘工藝條件為：當(dāng)鹽酸濃度0.12 mol/L，時(shí)間 120 min，料液比 1∶2，溫度 45℃時(shí)，除鎘率提高至87.21%，蛋白損失僅為16.5%。鎘含量在0.2～1.0 mg/kg的鎘污染大米經(jīng)處理后均能降至國家限量標(biāo)準(zhǔn)0.2 mg/kg以下。此方法相較于其他微生物發(fā)酵等除鎘方法，工藝操作簡單、成本低、效率更高。