楊英，楊艷麗

(甘肅省醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測(cè)所，甘肅 蘭州 730050)

中國(guó)是大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.]種植和進(jìn)口大國(guó)，中華人民共和國(guó)海關(guān)總署統(tǒng)計(jì)“十三五”期間我國(guó)大豆進(jìn)口超過(guò)8 500萬(wàn)噸/年，國(guó)家糧油信息中心估計(jì)2019年種植面積達(dá)1.3億畝，產(chǎn)量1 200萬(wàn)噸以上。我國(guó)已經(jīng)形成食品制作、榨油、養(yǎng)殖飼料等比較完善的大豆產(chǎn)業(yè)鏈，但加工過(guò)程中產(chǎn)生的大量豆渣、豆皮等工業(yè)副產(chǎn)品，由于其利用途徑合理性欠缺，在某種程度上造成了資源浪費(fèi)，其資源綜合利用亟待提質(zhì)增效。

豆渣主要成分是大豆蛋白(soy protein，SP)，可分離得到大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)，SPI系全價(jià)蛋白類食品添加劑，是為數(shù)不多的可替代動(dòng)物蛋白的植物蛋白品種，獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)特性，賦予其多種優(yōu)良材料特性，如結(jié)膜、發(fā)泡、凝膠、吸油、水合、乳化、無(wú)毒可食、生物相容、高機(jī)械強(qiáng)度，可作為優(yōu)良的藥物釋放系統(tǒng)、農(nóng)業(yè)保濕等生物材料。本研究通過(guò)跨行業(yè)、跨領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)，采用提質(zhì)增效模式，拓展了大豆豆渣工業(yè)副產(chǎn)品資源高質(zhì)化應(yīng)用領(lǐng)域，將有利于提升我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)鏈技術(shù)水平、擴(kuò)容產(chǎn)業(yè)鏈中下游涵蓋領(lǐng)域、增強(qiáng)產(chǎn)業(yè)鏈韌性。

1 材料與儀器

1.1 材料 大豆分離蛋白(SPI，南寧龐博士生物工程有限公司，批號(hào)：9010-10-0)；丙烯酰胺(AM，山東瑞海米山化工有限公司，批號(hào)：79-06-1)；過(guò)硫酸銨(APS，萊陽(yáng)雙雙化學(xué)廠，批號(hào)：7727-54-0)；N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA，天津市化學(xué)試劑研究所，批號(hào)：110-26-9)；殼聚糖(CS，山東奧康生物科技有限公司，批號(hào)：9016-76-4)；醋酸(樂(lè)山東承新材料有限公司，批號(hào)：33-87-001)；無(wú)水乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160606)。

1.2 儀器 Agilent 8453紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Agilent Technologies)；FD-1D-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；FTS3000紅外光譜儀(美國(guó)DigiLAB Merlin)；Pyris Diamond(熱重分析儀；PerkinElmer)；JSM - 6701F掃描電鏡(日本電子光學(xué)公司)。

2 方法

2.1 大豆分離蛋白/丙烯酰胺和殼聚糖共聚物(SPI/AGC)水凝膠的制備 0.1 g CS粉末，溶于6 mL 2%醋酸溶液，攪拌10 min；量取10 mL SPI分散液(0.5 g SPI分散于5 mL 8 mol·L-1尿素溶液)，并依次加入 0.5 g AM、0.1 g MBA，通N2，攪拌30 min。升溫至65 ℃，加入溶解0.03 g APS的1 mL二次蒸餾水，攪拌5 min，轉(zhuǎn)入圓柱瓶，置于65 ℃水浴鍋4 h，得淡黃色SPI/P(CS-g-AM)水凝膠(即大豆分離蛋白基共聚物水凝膠，縮寫(xiě)為SPI/AGC，其中CS-g-AM共聚物，縮寫(xiě)為AGC共聚物)，將制備的SPI/AGC水凝膠置于乙醇(30 mL)中浸泡12 h(每2 h換一次乙醇)，繼續(xù)浸泡過(guò)夜(12 h)，共計(jì)24 h。次日，在二次水中浸泡12 h(每2 h換一次水)，繼續(xù)浸泡過(guò)夜(12 h)，共計(jì)24 h。將除去雜質(zhì)的SPI/AGC水凝膠在冷凍干燥機(jī)中干燥，直接得到最終固體產(chǎn)品SPI/AGC干凝膠。

2.2 SPI/AGC水凝膠的結(jié)構(gòu)形態(tài) 不同狀態(tài)的SPI/AGC水凝膠在室溫下分別照相，得其形貌結(jié)構(gòu)圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 SPI分散性考察 球蛋白(約90%)和清蛋白(5%)是SPI的主要成分，球蛋白分子為橢球狀實(shí)體或緊密球狀，空間結(jié)構(gòu)折疊，肽鏈上疏水側(cè)鏈基團(tuán)埋藏在分子內(nèi)部，親水性分子(鹽鍵、酯鍵等)基團(tuán)暴露表面，只有當(dāng)親水性基團(tuán)暴露出來(lái)，才能對(duì)SPI進(jìn)行改性。由于SPI分子由氨基酸通過(guò)肽鍵縮合而成[1]，SPI在等電點(diǎn)附近幾乎不溶，但當(dāng)pH超過(guò)等電點(diǎn)，分散性隨著pH升高而增大，SPI分子內(nèi)氨基酸氨基與羧基的電離性，但較低pH時(shí)堿性氨基酸支鏈功能基及酸性氨基酸羧基質(zhì)子化，使蛋白質(zhì)帶正電荷；較高pH時(shí)質(zhì)子從堿性與酸性功能基被移除，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷[2]。蛋白質(zhì)帶電荷不同，性質(zhì)不同，溶液中的三維結(jié)構(gòu)也不同，故溶解度不同。試驗(yàn)表明，SPI在二次蒸餾水中不分散，而在0.1 mol·L-1NaOH溶液或者8 mol·L-1尿素溶液中分散性良好，高分子鏈處于松弛狀態(tài)(見(jiàn)圖1)。

圖1 SPI在不同介質(zhì)中的分散性

3.2 SPI/AGC水凝膠的制備機(jī)理 蛋白分子間主要結(jié)合力為氫鍵、二硫鍵、疏水鍵等。大豆球蛋白有酸性多肽鏈和堿性多肽鏈各一條，多肽鏈間二硫鍵連接[3]。β-伴大豆球蛋白是三聚體糖蛋白，由α，α′和β 3種亞基組成，有7種不同組合，亞基通過(guò)疏水鍵和氫鍵連接[4]。分散后的SPI骨架上有大量親水性基團(tuán)，如-NH2、-COOH、-OH等，可與AM、CS共聚物(AGC)上的活性基團(tuán)發(fā)生氫鍵或非共價(jià)鍵相互作用。因此，親水性聚合物AGC分布于SPI構(gòu)成相互貫穿的聚合物網(wǎng)絡(luò)，從而大分子在三維空間中以不同的鑲嵌方式構(gòu)成連環(huán)體。以MBA為交聯(lián)劑，APS為水溶性氧化還原引發(fā)劑，將SPI與AM、CS以不同比例共混，引發(fā)功能性單體CS和AM在水溶液中原位聚合，制備SPI/AGC水凝膠(見(jiàn)圖2)。

圖2 CS-g-AM接枝反應(yīng)方程式

3.2.1 不同原料比例對(duì)SPI/AGC水凝膠成型和性能的影響 功能性單體與SPI比例對(duì)合成SPI/AGC水凝膠性能影響很大。為了優(yōu)化合成條件，選取如表1所示比例，考察合成條件。各組樣品形貌結(jié)果如表1，發(fā)現(xiàn)當(dāng)SPI比例越大，凝膠成形性越差；該反應(yīng)制備SPI/AGC水凝膠結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，溶脹比與溶脹率均降低；其中SPI/AGC-3水凝膠組樣品成膠性和彈性均好。

表1 SPI/AGC水凝膠比例對(duì)凝膠性能的影響

圖3 SPI/AGC水凝膠比例對(duì)凝膠性能的影響

3.2.2 交聯(lián)劑用量對(duì)SPI/AGC水凝膠的性能影響 交聯(lián)劑不同濃度條件制備SPI/AGC水凝膠，性能迥異，隨著交聯(lián)劑量增加，SPI/AGC水凝膠中交聯(lián)點(diǎn)增多，高分子鏈結(jié)合密度增加，使水分子更難進(jìn)入凝膠網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致SPI/AGC水凝膠的平衡溶脹率越來(lái)越低。選擇3組不同濃度交聯(lián)劑的制備條件，考察交聯(lián)劑濃度對(duì)水凝膠成形性與溶脹度的影響，結(jié)果如表2。綜合考慮，SPI/AGC-j2水凝膠組交聯(lián)劑濃度下，制備SPI/AGC水凝膠成型性較優(yōu)。

表2 交聯(lián)劑濃度對(duì)SPI/AGC水凝膠性能的影響

3.2.3 溫度和時(shí)間對(duì)SPI/AGC水凝膠成型影響 選3組不同反應(yīng)溫度試驗(yàn)，考察了反應(yīng)溫度對(duì)互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠合成影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí)，SPI發(fā)生急劇變性而變成絮狀物，不能分散，反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行，溫度低于60 ℃時(shí)，不能引發(fā)產(chǎn)生自由基，聚合不能發(fā)生，65 ℃為最適聚合溫度。

選3組不同反應(yīng)時(shí)間試驗(yàn)，考察時(shí)間對(duì)水凝膠成型性與溶脹度的影響，結(jié)果如表3。試驗(yàn)觀察到SPI/AGC-t1水凝膠不成膠、SPI/AGC-t2水凝膠未完全成型，說(shuō)明單體和蛋白未完全反應(yīng)，而SPI/AGC-t3水凝膠聚合反應(yīng)完全，成型狀態(tài)完好。

表3 時(shí)間對(duì)SPI/AGC成型的影響

3.3 SPI/AGC水凝膠形態(tài)與結(jié)構(gòu)表征

3.3.1 SPI/AGC凝膠形態(tài) 制備的SPI/AGC水凝膠經(jīng)乙醇和二次蒸餾水洗滌，除去未反應(yīng)單體和其他雜質(zhì)。經(jīng)乙醇浸泡SPI/AGC水凝膠體積縮小，二次蒸餾水浸泡后溶脹體積變大。在冰箱中冰凍過(guò)夜，冷凍干燥后SPI/AGC水凝膠呈疏松孔狀，形貌結(jié)果如圖4。

圖4 SPI/AGC水凝膠在不同介質(zhì)中的形貌

3.3.2 SPI/AGC水凝膠的紅外光譜(FT-IR)譜圖 如圖5，1 650 cm-1和1 600 cm-1吸收分別為CS中酰胺的酰胺Ⅰ帶吸收，即C=O伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)吸收,而CS-AM接枝共聚物除3 450 cm-1附近出現(xiàn)-OH的O-H、-NH2的N-H伸縮振動(dòng)吸收外，1 668 cm-1有強(qiáng)吸收,為-CONH2特征吸收。說(shuō)明接枝共聚反應(yīng)后引入了酰胺基團(tuán)。同時(shí)-NH-彎曲振動(dòng)峰從1 380 cm-1和1 425 cm-1紅移到1 414 cm-1和1 455 cm-1,說(shuō)明AM在CS主鏈上形成接枝共聚物。

如圖6，3 373 cm-1附近N-H和O-H伸縮振動(dòng)峰，1 652 cm-1酰胺Ⅰ帶吸收為蛋白質(zhì)酰胺鍵C=O伸縮振動(dòng)吸收，1 554 cm-1呈酰胺Ⅱ帶特征吸收峰，為N-H彎曲振動(dòng)。1 215 cm-1C-N伸縮振動(dòng)酰胺Ⅲ帶吸收。SPI和AGC對(duì)比，SPI/AGC水凝膠在1 718 cm-1附近出現(xiàn)AGC中C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，同時(shí)在1 650、1 538、1 215 cm-1附近出現(xiàn)SPI酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶特征吸收峰，SPI/AGC水凝膠酰胺特征吸收帶有所增高即可初步推斷SPI經(jīng)改性后蛋白質(zhì)內(nèi)部可能形成新的氫鍵，表明本法制備SPI/AGC水凝膠成功。

3.3.3 SPI/AGC水凝膠的掃描電鏡(SEM) 如圖6，SPI球狀結(jié)構(gòu)、大小不均一、形狀不規(guī)則，AGC共聚物光滑的片狀結(jié)構(gòu)、表面呈不規(guī)則孔狀結(jié)構(gòu)，而SPI/AGC水凝膠表面呈規(guī)則孔狀結(jié)構(gòu)，其形貌明顯比AGC共聚物更易負(fù)載染色劑。

3.3.4 SPI/AGC水凝膠的熱重分析(TG) SPI、AGC共聚物和SPI/AGC水凝膠經(jīng)冷凍干燥后，熱重量分析實(shí)驗(yàn)條件為N2保護(hù)，升溫范圍25～800 ℃，升溫速度10 ℃·min-1(見(jiàn)圖7)。

圖5 SPI/AGC水凝膠、SPI及AGC共聚物的FT-IR譜圖

圖6 SPI/AGC水凝膠、SPI粉及AGC共聚物的掃描電鏡圖

圖7 SPI/AGC水凝膠、SPI和AGC共聚物的熱重分析

微商熱重分析表明，SPI/AGC水凝膠作為釋放系統(tǒng)或保濕材料，其釋放過(guò)程比SPI和AGC共聚物更敏感、穩(wěn)定、可控，有智能特性。

4 結(jié)論

本研究以SPI為基材，AM和CS為功能性單體，以水溶性APS為引發(fā)劑，MBA為交聯(lián)劑，利用原位聚合原理，制備SPI/AGC水凝膠，采用FT-IR、SEM和TG對(duì)SPI/AGC水凝膠表征結(jié)構(gòu)形貌等。表明本水凝膠制備成功，其相容性好[5]。該水凝膠可作為藥物載體可保持藥物分子的活性，對(duì)藥物有很好的控制釋放性能，作為藥物運(yùn)輸系統(tǒng)有很好的發(fā)展前景[6-7]。