趙 田，湯雅迪，趙一楠，宗艾倫，史曉鵬，周迎生

(首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

肥胖導致胰島β細胞功能紊亂，葡萄糖刺激下的胰島素分泌障礙，是2型糖尿病的主要危險因素。胰島β細胞異常表現(xiàn)的早期為胰島素分泌第一時相下降或消失[1]。既往研究表明，飲食控制減輕體重可以遏制或延緩肥胖向2型糖尿病進展。通過限食可以有效降低體重，引起機體適應性代謝改變，從而降低2型糖尿病、高血壓、心血管疾病和癌癥的患病風險[2-3]。然而，正常體重下的限食對體重及β細胞胰島素分泌功能的影響如何，是否會顯著改變胰島素分泌水平和胰島素敏感性對預防糖尿病有重要臨床意義。因此，本研究通過對C57BL/6小鼠進行高脂肥胖或限食減重干預，觀察胰島β細胞功能及形態(tài)學變化，提供研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，8周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]。在首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院實驗動物科學部實驗動物房完成飼養(yǎng)[SYXK(京) 2016-0027]，給予動物自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22℃～25℃，相對空氣濕度維持在45%～65%，12 h光照/黑暗交替環(huán)境。所有操作均符合實驗動物倫理學要求(倫理審批號：AEEI-2017-107)。隨機分為對照(n=12)、高脂肥胖(n=12)和限食組(n=12)，分別給予普通(Research Diets D12450 J)、高脂飼料(Research Diets D12492)連續(xù)飼喂12周，限食組采用普通飼料(Research Diets D12450 J)進行飼喂，以正常對照組每日攝食量的60%[4]作為限食組小鼠每日喂食量。實驗進程中，每日觀察小鼠的一般狀況，各組小鼠每周禁食12 h之后稱量小鼠體重一次。每隔2周，各組小鼠禁食不禁水12 h之后，通過在鼠尾靜脈采血，使用便攜式血糖儀測定各組小鼠空腹血糖。

1.2 主要試劑與儀器

膠原酶Ⅺ及胎牛血清購于Sigma-Aldrich公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司，生物合成人胰島素注射液諾和靈R購于諾和諾德中國制藥有限公司，蘇木素、伊紅等購于北京中杉金橋公司，小鼠超敏胰島素 ELISA 試劑盒 (Alpco 公司，型號80-INSMSU-E01)，血糖儀(Bayer公司，型號ContourTMTS)，體視顯微鏡(重慶重光儀器公司，型號SD111)，二氧化碳培養(yǎng)箱(上海善治儀器設備有限公司，型號HH. CT-P型)全自動組織脫水機(Leica公司，型號TP1020)，石蠟包埋機(Leica公司，型號EG1150 H)，石蠟切片機(Leica公司，型號RM2235)。

1.3 實驗方法

1.3.1 腹腔葡萄糖耐量試驗(intra-peritoneal glucose tolerance test, IPGTT)

飼養(yǎng)10周后行腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)[5]。小鼠禁食過夜16 h，給予腹腔注射25%葡萄糖 (2 g/kg)，鼠尾采血，血糖儀測定0 min及糖負荷后15 min、30 min、60 min、120 min的血糖，同時用微量采血吸管(北京紅星雙北醫(yī)療器材公司)鼠尾采血50 μL，4℃ 3000 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存，ELISA法待測血漿胰島素濃度，并計算以下指標：

(1)胰島素生成指數(shù)：用于評估早時相胰島素分泌，計算公式如下[6]：[15 min血漿胰島素(μU/mL)-空腹血漿胰島素] / [15 min血糖(mmol/L)-空腹血糖]。

(2)胰島素曲線下面積(area under the curve, AUCi)：應用梯形面積法計算120 min胰島素曲線下面積，用于評估第二時相胰島素分泌。

1.3.2 胰島素耐量實驗(insulin tolerance test，ITT)

胰島素耐量實驗反映胰島素敏感性。小鼠禁食不禁飲6 h，按體重腹腔注射人短效胰島素(0.75 mU/g)，分別測定注射前、注射后 15 min、30 min、60 min 及 120 min 血糖水平，采用胰島素注射后血糖除以基礎血糖表示血糖變化程度，繪制血糖變化曲線，計算血糖曲線下面積(AUC)并進行統(tǒng)計分析。

1.3.3 小鼠胰島的分離、純化

小鼠禁食過夜，采用膠原酶消化分離胰島，實驗方法參照文獻進行[1,7]，胰島過夜培養(yǎng)以使胰島功能恢復，并用于胰島素分泌實驗及胞漿胰島素含量測定實驗。倒置顯微鏡拍照，測量胰島直徑。

1.3.4 葡萄糖刺激的胰島素分泌實驗(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)

胰島置于KRBH緩沖液(0.5%BSA)中在37℃ CO2培養(yǎng)箱中預孵育1 h，取大小匹配的胰島移入24孔板，每孔10個，加入含2.8 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖的KRBH刺激液，每孔2 mL，孵育1 h。收集上清液用于胰島素釋放測定，根據(jù)既往研究中的方法完成小鼠胰島的胰島素分泌實驗[4]。高糖刺激的胰島素分泌/基礎胰島素分泌即為刺激指數(shù)(stimulation index, SI)，它常用于評估胰島對葡萄糖的反應能力。

1.3.5 胰島素濃度測定

采用小鼠超敏胰島素試劑盒測定。從-80℃冰箱中取出樣本，放置至室溫，渦旋混勻 5 s，按照既往研究中方法測定胰島素濃度[8]。

1.3.6 標本采集

小鼠禁食過夜12 h，1%戊巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射麻醉，測量體重、體長(鼻尖至肛門外沿的距離)、腹圍，計算Lee’s指數(shù)[9]，Lee’s指數(shù)=體重(g)1/3/體長(cm)×1000。完整剪取雙側附睪脂肪、雙側腎周脂肪及重要器官組織，迅速稱量濕重。

1.3.7 胰腺HE染色

胰腺組織脫水后石蠟包埋(EG1150 H，Leica公司，德國)，切片厚度6 μm，室溫下30%乙醇中展片時間 2～3 min后，80℃烤箱內(nèi)烤100 min，以防止組織后續(xù)染色中脫落。石蠟切片脫蠟，經(jīng)蘇木素、伊紅染色，膠封片觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 小鼠體重及能量攝入變化

8周齡小鼠在喂養(yǎng)1周時，高脂肥胖組體重超過限食組，差異有統(tǒng)計學意義(25.9±0.6)gvs(22.8±0.8)g， (P=0.019)，2周后則高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(28.3±0.7)gvs(23.9±0.4)g，(P<0.001)。限食組小鼠在限食2周后，體重低于正常對照組(21.4±0.6)gvs(23.9±0.4)g，(P=0.015)，見圖1A。限食組小鼠的攝入食物能量是正常對照組的60%，根據(jù)對照組能量攝入調(diào)整限食組熱量。經(jīng)過12周的高脂喂養(yǎng)，高脂肥胖組小鼠的能量攝入量較對照組增加了22.9% (70.6±1.2) kJ/(天·只)vs(54.4±1.4) kJ/(天·只)，(P<0.001)(見圖1B)。

注：A. 小鼠體重變化；B.小鼠能量攝入變化。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001；與高脂肥胖組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。圖1 飲食影響小鼠體重及能量攝入變化Note. A, Body weight changes in the mice. B, Energy intake changes in the mice. Compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the high-fat obesity group, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 1 Body weight and energy intake changes in the mice

2.2 高脂及限食對小鼠體重及脂肪量的影響

實驗終點時，高脂肥胖組小鼠的體重比對照組體重增加了55.7%(P<0.001)，比限食組小鼠體重增加了79%(P<0.001)，高脂喂養(yǎng)小鼠表現(xiàn)為顯著腹型肥胖、腹圍明顯增加，體內(nèi)胰腺、肝及脂肪組織(腎周、附睪旁)均顯著增加(P<0.05)。相反，限食組小鼠的體重、腹圍以及肝、腎周脂肪重量均顯著低于正常對照組(P<0.05)，但胰腺、附睪脂肪重量等與對照組的差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高脂肥胖組空腹胰島素是對照組的3.6倍(P<0.001)。見表1。

表1 實驗終點時小鼠的代謝參數(shù)

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與高脂肥胖組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with high-fat obesity group,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001.

2.3 高脂及限食對胰島素敏感性的影響

經(jīng)過8周飼養(yǎng)，采用胰島素耐量實驗評估高脂及限食對胰島素的敏感性。高脂小鼠對胰島素的敏感性降低，血糖下降的比例低于對照組和限食組，胰島素耐量血糖下面積大于對照組和限食組。限食組相比于對照組無明顯差異，在120 min時血糖低于對照組(3.0±0.3) mmol/Lvs(4.2±0.4) mmol/L(P<0.05)，胰島素注射后血糖與基礎血糖的比值在各時間段均無明顯統(tǒng)計學差異，見圖2。

注A、B： ITT血糖及血糖曲線下面積的比較。C、D：血糖/基礎血糖(%)及曲線下面積的比較。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001；與高脂肥胖組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。圖2 高脂及限食對胰島素敏感性的影響。Note. A, B，The ITT blood glucose levels and the area under the blood glucose curve in the control, high-fat obesity, and calorie restriction groups. C, D， Ratio (%) of blood glucose to basal glucose concentrations in ITT (C) and the area under the curve (D) among groups. Compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the high-fat obesity group, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 2 Effects of high fat and calorie restriction on insulin sensitivity

2.4 高脂及限食對小鼠糖耐量、早時相及第二時相胰島素分泌影響

采用IPGTT實驗評估高脂及限食對胰腺β細胞分泌胰島素功能的影響。高脂肥胖組小鼠的空腹血糖及血糖曲線下面積比對照組分別增加44.6%(P<0.01)、45.4%(P<0.001)，胰島素曲線下面積增加了1.2倍(P<0.001)，比限食組增加了1.7倍。而限食組小鼠各時間點的血漿胰島素水平和早相胰島素分泌與正常對照組的差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但血糖曲線下面積相比于對照組降低了70.8% (P<0.05)，見圖3。

注：A、B： IPGTT實驗中血糖水平及血糖曲線下面積。C、D： IPGTT實驗中胰島素水平及胰島素曲線下面積。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與高脂肥胖組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。圖3 高脂及限食對糖耐量、早時相和第二時相胰島素分泌的影響(n=8)Note. A, B， The IPGTT blood glucose levels and the area under the blood glucose curve among groups. C, D， The IPGTT blood plasma insulin levels and the area under the plasma insulin curve among groups. Compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with high-fat obesity group, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 3 Effects of high fat and calorie restriction on glucose tolerance, early phase and second phase insulin secretion

2.5 高脂及限食對胰島形態(tài)的影響

實驗終點胰腺組織HE染色顯示如圖4A所示。高脂肥胖組的小鼠染色結果顯示胰島體積明顯肥大，同一視野下胰島及其內(nèi)分泌細胞數(shù)量明顯增加。限食組小鼠染色結果顯示胰島形態(tài)規(guī)則完整，結構清晰，同一視野下胰島及其內(nèi)分泌細胞數(shù)量明顯減少。研究終點體外分離胰島，定量分析測量胰島直徑，結果如圖4B所示，高脂肥胖組胰島直徑比正常對照組增加了9.5% (173.6±15.2)μmvs(158.2±13.5)μm，(P<0.001),比限食組增加了 21.2% (173.6±15.2)μmvs(143.2±8.6)μm，(P<0.001)。限食組小鼠的胰島直徑最小，比正常對照組減少了10.1%(P<0.05)。

注：A：三組小鼠胰腺切片的代表性HE染色圖像(×400)。B：三組小鼠胰島分離結果，每組測量4只小鼠的胰島。圖4 高脂及限食對胰島形態(tài)的影響。Note. A, Representative HE-stained images of pancreatic tissue (×400). B, Results of islet isolation in three groups of mice. The islets of 4 mice were measured in each group.Figure 4 Effect of high fat and calorie restriction on islet morphology

2.6 離體胰島的葡萄糖刺激胰島素分泌實驗(GSIS)

高脂肥胖組的基礎胰島素分泌比對照組增加了23.5%(P<0.05)，比限食組增加了61.5%(P<0.01)，而高糖刺激的胰島素分泌降低了25.3%(P<0.05)，比限食組降低了28.1%(P<0.001)，提示高脂肥胖組小鼠胰島表現(xiàn)為葡萄糖刺激時胰島素分泌降低。限食組小鼠高糖刺激的胰島素分泌與對照組相比無無統(tǒng)計學意義的差別(P>0.05)，見圖5 A。限食組的刺激指數(shù)最高，比正常對照組增加了34.8% (P=0.012)，比高脂肥胖組增加了1.2倍(P<0.001)，見圖5B。

注：A： 離體胰島在2.8 mmol/L葡萄糖和16.7 mmol/L葡萄糖刺激下的胰島素分泌。B： 胰島的刺激指數(shù)。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001；與高脂肥胖組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。圖5 高脂及限食對離體小鼠胰島GSIS的影響(n=5)Note. A, Glucose-stimulated insulin secretion was measured in isolated islets at 2.8 and 16.7 mmol/L glucose. B, The stimulation index calculated by dividing insulin secretion in response to 16.7 mmol/L glucose by that in response to 2.8 mmol/L glucose. Compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with high-fat obesity group, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 5 Effect of high fat and calorie restriction on glucose-stimulated insulin secretion in isolated islets

3 討論

本研究中高脂肥胖組小鼠經(jīng)過12周喂養(yǎng)出現(xiàn)顯著肥胖，腹圍、Lee指數(shù)、臟器(附睪脂肪、肝、胰腺)重量增加，糖耐量受損和胰島素抵抗加重，伴有胰島代償性肥大，與既往文獻報道一致[10-13]。胰島β細胞是生成和釋放胰島素的部位。離體胰島實驗顯示高脂肥胖組胰島素含量增加，但存在胰島素分泌缺陷，即在2.8 mmol/L葡萄糖刺激時基礎胰島素分泌增加而16.7 mmol/L葡萄糖刺激的胰島素分泌降低，提示高脂肥胖組小鼠的β細胞功能紊亂并非由于胰島素儲備不足，而是由于缺陷性的分泌。肥胖可引起外周胰島素抵抗，會導致胰島β細胞的功能紊亂，表現(xiàn)為胰島素分泌雙時相正常，而胰島素分泌水平增加。在葡萄糖鉗夾試驗中，胰島素分泌表現(xiàn)為第一時相和第二時相分泌；在血糖升高數(shù)分鐘內(nèi)，胰島素分泌急劇增加后快速下降，形成第一時相；隨之出現(xiàn)胰島素緩慢增加，持續(xù)至血糖下降到基線水平，形成第二時相[14]。本研究中高脂肥胖組早時相胰島素分泌趨向降低，但第二時相胰島素分泌顯著升高。這種現(xiàn)象常見于糖耐量減低及早期的T2DM患者，隨著病情進展，到了T2DM后期第二分泌相也較低平[15]。在胰島β細胞僅有分泌功能障礙，而未出現(xiàn)顯著的組織學改變之前，早期干預，胰島功能受損是可逆的[16]。

飲食控制能量攝入可以有效減低體重，長期攝入足夠營養(yǎng)素的限食會引起適應性代謝改變[2-3]。對C57BL/6J小鼠進行正常飲食和禁食各24 h交替的間斷禁食12周，胰島素敏感性增加，糖耐量改善[17]。限食已被證明可以延長嚙齒動物和靈長類動物的健康狀況和壽命[18]。限食對于小鼠胰島β細胞的功能影響尚無具體研究。本課題組對C57BL/6小鼠進行限食研究其胰島功能改變。小鼠經(jīng)40%的限食后，胰島面積比對照組變小，胞漿胰島素含量降低，但葡萄糖刺激的胰島素分泌仍正常，提示正常限食后胰島素儲備而非胰島素分泌減少。限食組小鼠糖負荷后血糖降低，而血漿胰島素水平正常，這一結果與既往研究一致[19-20]。限食減輕體質(zhì)量、改善血糖水平的原因可能是長期供能不足，限食組小鼠的胰島素敏感性升高，糖負荷后可以快速利用葡萄糖。

在動物研究中，減少大鼠和小鼠熱量攝入20%～50%，可將其中位和最大生存時間延長50%，并可預防或延遲多種慢性疾病如肥胖、2型糖尿病、腎病、心肌病的發(fā)病[21]。Gao等[4]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過3周40%的限食干預，高脂飲食轉(zhuǎn)為限食組的小鼠體重降至正常，并且糖耐量、胰島素敏感性、胰島素分泌和胞漿胰島素含量均完全恢復正常。而高脂飲食轉(zhuǎn)為普通飲食3周后小鼠的糖耐量恢復正常，體重有所降低但未恢復正常，早時相胰島素分泌及離體胰島的高糖刺激的胰島素分泌較高脂肥胖組并無改善[4]。

高脂飲食增加小鼠體質(zhì)量，出現(xiàn)糖耐量受損和胰島素抵抗，胰島代償性肥大伴隨胰島素分泌缺陷，而中度的限食能明顯降低小鼠體質(zhì)量和血糖，不影響胰島素分泌反應，但空腹血胰島素水平降低。本研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高脂肥胖對胰島素分泌的損傷作用，但其損傷機制的分子生物學研究，尚需進一步實驗探討。