吳運(yùn)斗，袁新科，李大勇，彭 琳，田俊瑋

(長沙市第一醫(yī)院腎內(nèi)科，長沙 410005)

目前認(rèn)為威脅人類生命的三大慢性非傳染病為糖尿病、腫瘤、心血管疾病，糖尿病的發(fā)生不僅會使血糖升高，還會引發(fā)一系列的并發(fā)癥，如腎病、心腦血管疾病，其中糖尿病腎病是臨床最為常見的糖尿病并發(fā)癥，且發(fā)病率逐漸上升，已經(jīng)成為終末期腎臟病的主要危險因素[1-2]。喹磺環(huán)己酮屬于一種第二代磺脲類降糖藥物，其95%的代謝產(chǎn)物不會經(jīng)過腎臟途徑進(jìn)行排泄，可對腎臟組織進(jìn)行保護(hù)，此藥為高活性的胰島β細(xì)胞激動劑，能夠通過和胰島β細(xì)胞膜上的特異性磺脲類受體的結(jié)合作用，對胰島細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，使其產(chǎn)生適量的胰島素，進(jìn)而對高血糖濃度進(jìn)行降低，具備較好的降糖功效[3-4]。因此在本文研究中為驗證喹磺環(huán)己酮降糖、保護(hù)腎臟組織的作用，建立糖尿病腎病大鼠模型，研究喹磺環(huán)己酮對糖尿病腎病大鼠的作用及對大鼠腎臟腎臟血管緊張素Ⅱ(angiotensin II，AngⅡ)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗動物

選取40只8周齡SPF級SD健康雄性大鼠，體重200～250 g，平均體重(224.6±6.5)g,由長沙市第一醫(yī)院腎內(nèi)科實(shí)驗室所提供動物生產(chǎn)許可證號[SCXK(湘)2019-0005]，動物的使用許可證號[SYXK(湘)2019-00179]。所有大鼠均養(yǎng)殖在長沙市第一醫(yī)院腎內(nèi)科實(shí)驗室中的干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲凈化水，飼養(yǎng)時間為一周。本文研究實(shí)驗獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)，IACUC審批號：IACUC-01-2019。

1.2 主要試劑與儀器

喹磺環(huán)己酮(江西匯仁藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20058903)，小鼠抗大鼠空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)抗體(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司，貨號：PA123512)、小鼠抗大鼠糖化血紅蛋白(Glycosylated hemoglobin，HbA1c)抗體(上?？泼羯锟萍加邢薰?，貨號：MAB7186)、24 h尿微量白蛋白(24-hour urinary microalbumin，24hU-mAlb)試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，貨號：YE01886)、小鼠抗大鼠β2微球蛋白(β2 microglobulin，β2-MG)抗體(上海江萊生物科技有限公司，貨號：KAY0004)、小鼠抗大鼠血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)抗體(武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，貨號：MU30802)、兔抗大鼠AngⅡ抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：K002826P)、VEGF抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：bs-0279R-1)；兔抗人單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：bs-1955R-1)、兔抗人凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor，LOX-1)抗體(武漢博歐特生物科技有限公司，貨號：orb192272)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色劑(上海樊克生物科技有限公司，貨號：FK-F1618)、糖原染色液(Glycogen dye，PAS)染色劑(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：G2450)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：P1010)。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 分組、建模

隨機(jī)選取40只大鼠中10只作為正常組，其余30只建立糖尿病腎病大鼠模型。參照Elsherbiny等[5]研究中糖尿病腎病模型的建立方法，建立糖尿病腎病模型大鼠，對所有大鼠隔夜禁食16 h，之后一次性腹腔注射60 mg/kg 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，正常組大鼠注射檸檬酸緩沖液，注射方法和注射量與其余兩組大鼠保持一致。3 d之后采集建模大鼠尾部靜脈血，對血糖水平進(jìn)行檢測，血糖>16.7 mmol/L為糖尿病模型建模成功標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病模型建模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)2周，收集糖尿病大鼠24 h尿量，并對24 h尿蛋白水平進(jìn)行檢測，24 h尿量>建模前150%；24 h尿蛋白≥30 mg視為糖尿病腎病模型建立成功。模型成功后隨機(jī)將兩組糖尿病腎病大鼠分為模型組10只和給藥組各20只。

1.3.2 給藥干預(yù)

給藥組每5只大鼠注射相同劑量，分別使用5、10、15、30 mg/kg的喹磺環(huán)己酮灌胃，對照組和模型組大鼠給予等劑量的生理鹽水灌胃，連續(xù)治療12周后，觀察大鼠變化。

1.3.3 Uaer、GFR檢測

采集正常組、給藥組大鼠尾部靜脈血2 mL,使用3000 r/min離心機(jī)離心處理20 min后，分離出上層血清，保存待檢；并留取兩組大鼠24 h尿液，使用3000 r/min離心機(jī)離心處理20 min后，分離出上清液，保存待檢。對正常組、給藥組大鼠Uaer、GFR水平進(jìn)行檢測，其中GFR=(尿肌酐/血肌酐)×尿量/體重。

1.3.4 一般指標(biāo)檢測

抽取三組大鼠尾部靜脈血2 mL，使用全自動生化分析儀對三組大鼠FBG、HbA1c、HOMA-IR水平進(jìn)行檢測。采用穩(wěn)態(tài)評模型評估法(HOMA)檢測胰島素抵抗指數(shù)，胰島素抵抗指數(shù)(Insulin resistance index，HOMA-IR)=空腹胰島素(國際單位/L)×空腹葡萄糖(mmol/L)/22.5。取三組大鼠尾部靜脈血2 mL,使用3000 r/min離心機(jī)離心處理20 min后，分離出上層血清，保存待檢。使用免疫透射比濁法檢測24hU-mAlb、β2-MG、BUN水平，取三個試管，分別標(biāo)記為空白管、標(biāo)準(zhǔn)管以及測定管?？瞻坠苤屑尤?5 μL生理鹽水和350 μL Tris緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)管中加入15 μL定標(biāo)液和350 μL Tris緩沖液，測定管中加入15 μL待測標(biāo)本和350 μL Tris緩沖液，對三個試管分別搖晃混勻后，在37℃的環(huán)境中保存5 min，在波長340～700 nm處讀各管吸光度。之后在三個試管中分別加入羊抗人24hU-mAlb、β2-MG、BUN抗血清，分別搖晃混勻后在37℃的環(huán)境中保存5 min，在波長340～700 nm處讀各管吸光度，并對血清β2-MG、BUN水平進(jìn)行計算。

1.3.5 樣本采集

對3組大鼠進(jìn)行全麻處理后，采用斷頭法處死，摘取3組大鼠左側(cè)腎臟去除被膜，左側(cè)腎臟，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，固定，4℃保存?zhèn)溆靡宰鞑±恚挥覀?cè)腎臟放置于冷凍管中，置于液氮罐中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 染色處理

將預(yù)先固定好的左側(cè)腎臟組織切片取出行脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、染色(HE染色、PAS染色)，之后脫水、透明，待封片晾干后在顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1.3.7 腎臟組織勻漿處理

取200 mg的腎臟組織進(jìn)行剪碎處理，使用PBS緩沖液進(jìn)行漂洗，將血液除去，使用濾紙拭干，稱重。將組織塊研碎并加入組織塊質(zhì)量9倍的PBS緩沖液，和勻制成10%腎組織勻漿。將制備好的腎組織勻漿用低速離心機(jī)3000 r/min離心15 min，棄沉淀留上清，-80℃保存待用

1.3.8 MCP-1 mRNA、LOX-1 mRNA檢測

腎臟組織用RNA試劑盒提取后，定量，并行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性；2 min，1個循環(huán)；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72℃總延伸6 min。反應(yīng)結(jié)束后，70℃～95℃進(jìn)行20 s(步進(jìn)0.5℃/s)熔解曲線分析，鑒定PCR產(chǎn)物的特異性。使用SDS軟件分析PCR過程各檢測樣本的循環(huán)閾值(cycle threshold，CT)。MCP-1引物序列：上游引物：5’-TCTGGGCCTGTTGTTCACAGT-3’(21 bp)、下游引物：5’-TGCTGCTGGTGATTCTCTTGTAGT-3’(24 bp)；LOX-1引物序列：上游引物：5’-GGTATGGGTTGATGTTGAGGA-3’(20 bp)、下游引物：5’-TGTGATGGGGTGTTGTGAAT-3’(25 bp)；β-actin引物序列：上游引物：5’-CATGGTGGCTGTG GTCACCTCG-3’、下游引物：5’-GCCCACGCTGT ATCTCCTGGTCG-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物：602 bp。

1.3.9 AngⅡ、VEGF水平檢測

使用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢腎臟組織中AngⅡ、VEGF水平，采用50 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進(jìn)行溶解，濃度為10～20 μg/mL，在96孔酶標(biāo)板中加入每孔100 μL，4℃過夜保存。第2天舍棄包被液，采用PBST洗滌3次，每孔中加入1%的150 μL BSA，在37℃環(huán)境中封閉1 h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100 μL不同倍比稀釋度的血清，加入對照樣品，37℃孵育2 h。采用PBST洗滌5次，加入100 μL,稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，之后，使用顯色劑顯色20 min后，在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 正常組大鼠、給藥組大鼠Uaer、GFR水平比較

如表1所示，5、10、15 mg/kg劑量給藥大鼠Uaer、GFR水平均高于正常水平，30 mg/kg劑量給藥大鼠Uaer、GFR水平低于正常水平，其中劑量為15 mg/kg時大鼠Uaer、GFR水平趨近于正常Uaer、GFR水平，因此認(rèn)為15 mg/kg為適宜給藥劑量，下文研究均以15 mg/kg的劑量進(jìn)行研究。

2.2 三組大鼠一般指標(biāo)水平比較

如表2所示，模型組、給藥組大鼠FBG、HbA1c、HOMA-IR、24hU-mAlb、β2-MG、BUN水平均高于正常組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；給藥組大鼠FBG、HbA1c、HOMA-IR、24hU-mAlb、β2-MG、BUN水平均低于模型組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.3 三組大鼠病理組織學(xué)觀察

如圖1、圖2所示，為三組大鼠腎臟組織HE、PAS染色圖，由HE染色圖可見，正常組大鼠腎小管、腎小球、系膜基質(zhì)無病理變化，腎臟組織正常；模型組大鼠出現(xiàn)系膜基質(zhì)增生、系膜細(xì)胞增多以及腎小球硬化，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生空泡變性；給藥組大鼠腎臟病理變化逐漸減輕，腎小管、腎小球體積與正常組大鼠腎小管、腎小球體積大小相當(dāng)。由PAS染色圖可見，正常組大鼠腎臟組織正常，無陽性物質(zhì)，模型組大鼠腎臟組織中小葉中央部出現(xiàn)大量的PAS陽性物質(zhì)，腎小球發(fā)生彌漫性的病變，出現(xiàn)較多的系膜基質(zhì)，腎小球基底膜異常增厚，出現(xiàn)小動脈玻璃樣的病變，腎小球出現(xiàn)結(jié)節(jié)；給藥組大鼠腎小球基底膜、腎小管病變均消失，但仍由增多的腎小球基質(zhì)、系膜細(xì)胞。

表1 正常組大鼠、給藥組大鼠Uaer、GFR水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05，；與5 mg/kg劑量給藥組比較，△P<0.05；與10 mg/kg劑量給藥組比較，▲P<0.05；與15 mg/kg劑量給藥組比較，○P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the 5 mg/kg dose group,△P<0.05. Compared with the 10 mg/kg dose group,▲P<0.05.Compared with the 15 mg/kg dose group，○P<0.05.

表2 三組大鼠一般指標(biāo)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.

2.4 三組大鼠腎臟組織中MCP-1 mRNA、LOX-1mRNA表達(dá)水平比較

如表3所示，模型組、給藥組大鼠腎臟組織中MCP-1 mRNA、LOX-1mRNA表達(dá)水平均高于正常組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；給藥組大鼠腎臟組織中MCP-1 mRNA、LOX-1mRNA表達(dá)水平均低于模型組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.5 三組大鼠腎臟組織中AngⅡ、VEGF表達(dá)水平比較

如表4所示，模型組、給藥組大鼠腎臟組織中AngⅡ、VEGF表達(dá)水平均高于正常組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；給藥組大鼠腎臟組織中AngⅡ、VEGF表達(dá)水平均低于模型組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖1 三組大鼠腎臟組織的病理改變(HE染色)Figure 1 Pathological changes in kidney tissues of the three groups of rats(HE staining)

圖2 三組大鼠腎臟組織PAS染色觀察圖Figure 2 Pathological changes in kidney tissues of the three groups of rats(PAS staining)

組別GroupsnMCP-1LOX-1正常組Normal group100.52±0.010.40±0.01模型組Model group100.92±0.04?0.89±0.11?給藥組Drug administration group(15 mg/kg)50.83±0.07?#0.51±0.07?#F21.387.59P<0.05<0.05

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

Note.Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.

表4 三組大鼠腎臟組織中AngⅡ、VEGF表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

Note.Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.

3 討論

糖尿病腎病屬于一種糖尿病并發(fā)的微血管病變，此病發(fā)生后一般病情比較嚴(yán)重，嚴(yán)重者會導(dǎo)致患者死亡[6]。因此尋找治療糖尿病腎病的有效藥物尤為重要，在本文研究實(shí)驗中基于尋找糖尿病腎病的治療藥物來研究喹磺環(huán)己酮在糖尿病腎病中的作用及對腎臟中AngⅡ、VEGF表達(dá)的影響。

喹磺環(huán)己酮又被稱為格列喹酮，屬于磺脲類藥物，此類藥物能夠減少血容量不足多導(dǎo)致的腎臟局部缺氧現(xiàn)象，能夠?qū)δI臟功能進(jìn)行改善和保護(hù)，并且此類藥物僅有5%的代謝產(chǎn)物經(jīng)過腎臟途徑進(jìn)行排泄，不會對腎臟產(chǎn)生較大的負(fù)擔(dān)，會對腎臟組織起到保護(hù)作用[7-8]。在本文研究中建立糖尿病腎病大鼠模型，給予大鼠喹磺環(huán)己酮進(jìn)行干預(yù)治療，給藥組大鼠分別使用不同劑量的喹磺環(huán)己酮灌胃，研究喹磺環(huán)己酮適宜濃度，對比正常組大鼠與給藥組大鼠Uaer、GFR水平，結(jié)果顯示30 mg/kg劑量給藥大鼠Uaer、GFR水平低于正常水平，其中劑量為15 mg/kg時大鼠Uaer、GFR水平趨近于正常Uaer、GFR水平，因此認(rèn)為15 mg/kg為適宜給藥劑量，下文研究均以15 mg/kg的劑量進(jìn)行研究。魯怡然等[9]在其研究中建立糖尿病腎病大鼠，給予大鼠格列喹酮治療，研究結(jié)果顯示，格列喹酮可有效改善腎臟組織病變，且可有效改善高血糖水平，與本文研究結(jié)果認(rèn)為喹磺環(huán)己酮保護(hù)腎臟組織一致。糖尿病腎病是在糖尿病的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，因此此類患者血糖會出現(xiàn)異常的升高[10]。

糖尿病腎病發(fā)生后，腎臟組織中MCP-1、LOX-1呈現(xiàn)高表達(dá)。MCP-1能夠誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞中的鈣離子濃度升高，對其表面黏附因子的表達(dá)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)節(jié)[13]。LOX-1屬于氧化低密度脂蛋白的新型受體，對氧化低密度脂蛋白具有特異性的結(jié)合、吞噬、降解的作用[14]。在本文研究中，對三組大鼠腎臟組織中MCP-1、LOX-1mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，模型組、給藥組大鼠腎臟組織中MCP-1、LOX-1mRNA表達(dá)水平均高于正常組，而給藥組大鼠腎臟組織中MCP-1、LOX-1mRNA表達(dá)水平均低于模型組，此結(jié)果說明，喹磺環(huán)己酮可改善糖尿病腎病大鼠腎臟組織中MCP-1、LOX-1mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而對大鼠腎臟組織進(jìn)行保護(hù)。

血管緊張素參與糖尿病腎病早期腎臟血管的重建，其中AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中較為重要的一種活性物質(zhì)，其收縮出球小動脈的能力與收縮入球小動脈的能力相比，其收縮出球小動脈的能力較強(qiáng)，此現(xiàn)象可致使腎小球內(nèi)出現(xiàn)壓力差，讓腎小球長時間的處于高壓、高濾過的狀態(tài)，進(jìn)而增加蛋白濾過[15-17]。有研究認(rèn)為，由于糖尿病腎病發(fā)生后，體內(nèi)持續(xù)的高血糖會將蛋白酶C進(jìn)行激活，進(jìn)而促進(jìn)VEGF基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄作用，導(dǎo)致腎小球系膜上的VEGF表達(dá)水平上升[18]。機(jī)體長期處于高血糖的狀態(tài)下會使得血管緊張素轉(zhuǎn)化成酶基因，并且呈現(xiàn)出高表達(dá)的狀態(tài)，進(jìn)一步導(dǎo)致AngⅡ表達(dá)水平的異常表達(dá)，對蛋白激酶β亞型起到活化作用，最終導(dǎo)致VEGF表達(dá)水平上升[19-20]。在本文研究中，對3組大鼠腎臟組織中AngⅡ、VEGF表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，模型組、給藥組大鼠腎臟組織中AngⅡ、VEGF表達(dá)水平均高于正常組，而給藥組大鼠腎臟組織中AngⅡ、VEGF表達(dá)水平均低于模型組，此結(jié)果提示著糖尿病腎病可改善腎臟組織中AngⅡ、VEGF的表達(dá)，進(jìn)而對糖尿病腎病大鼠腎功能和腎臟病變進(jìn)行改善。

綜上所述，喹磺環(huán)己酮可能是通過抑制糖尿病腎病大鼠腎臟組織中AngⅡ、VEGF的表達(dá)，改善大鼠腎功能和腎臟病變，最終起到腎臟保護(hù)的效果。