萬(wàn)爭(zhēng)艷，李 寧，向玲玲，陳 瑩，梅紅彬，董紅霞

(武漢市優(yōu)撫醫(yī)院，武漢 430023)

精神分裂癥是一種復(fù)雜的精神病，在精神分裂癥中，前額葉皮質(zhì)區(qū)域中功能和結(jié)構(gòu)受損，在背外側(cè)前額葉皮層最常見(jiàn)[1-2]。血腦屏障高度限制血液循環(huán)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的分子、離子和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，以保護(hù)大腦[3]。據(jù)報(bào)道，各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括腦缺血性中風(fēng)、水腫、感染、癲癇、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病和帕金森病都與血腦屏障的分解有關(guān)[4-6]。環(huán)磷酸腺苷依賴蛋白激酶(cyclic adenosine monophosphate dependent protein kinase，PKA)依賴的方式激活內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子-5(C-C motif ligand 5，CCL5)基因表達(dá)[7]。人和小鼠細(xì)胞質(zhì)末端結(jié)構(gòu)域中CCL5的磷酸化位點(diǎn)負(fù)責(zé)內(nèi)皮屏障對(duì)小分子的選擇性通透性增加[8]。與腦炎性病變相關(guān)的藥劑陣列表明，大量的效應(yīng)和反應(yīng)組合可能參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[9]。趨化因子是一組調(diào)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)的分子，參與炎癥期間各種炎性細(xì)胞的表達(dá)，趨化因子通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)受體的相互作用發(fā)出信號(hào)[10]。趨化因子活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌，能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中促炎介質(zhì)的合成，趨化因子刺激后，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞啟動(dòng)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1，IL-17，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)-1α，MIP-1β，MIP-2的轉(zhuǎn)錄[11]。因此，在本研究中，筆者建立了精神分裂癥大鼠模型，觀察病理?yè)p傷和前額葉皮質(zhì)PKA和內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子-5表達(dá)變化，闡明其神經(jīng)損傷機(jī)制，為指導(dǎo)臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

篩選30只6～8周齡的SPF 級(jí)250 g雄性SD大鼠(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK-(軍)2017-0004][SYXK-(軍)2017-0004])飼養(yǎng)在帶有過(guò)濾器的籠子中，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行無(wú)差別飼養(yǎng)一周，動(dòng)物設(shè)施和飼養(yǎng)符合動(dòng)物保護(hù)原則。誘導(dǎo)7 d后麻醉舌下取血，處死后對(duì)腦部前額葉皮質(zhì)進(jìn)行病理組織鏡檢。注：動(dòng)物使用的倫理審批號(hào)IACUC為2017-0015；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遵循3R原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精神分裂癥模型構(gòu)建

為了誘導(dǎo)精神分裂癥實(shí)驗(yàn)大鼠，對(duì)誘導(dǎo)組大鼠每日腹腔注射苯丙胺0.5 mg/kg(濃度為0.1 mg/mL，給藥容量為5 uL/g)，連續(xù)7 d。對(duì)照組皮下注射生理鹽水。其他環(huán)境相同，建模時(shí)間持續(xù)7 d，期間記錄兩組大鼠的異常情況和死亡情況，本研究期間無(wú)大鼠自然死亡發(fā)生。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

30只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(為正常飼養(yǎng)大鼠，皮下注射生理鹽水，n=15)誘導(dǎo)組(每天皮下注射苯丙胺誘導(dǎo)腦部損傷建立精神分裂模型，n=15)[12]，兩組大鼠在37℃下籠中飼養(yǎng)。7 d后對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行手術(shù)處理實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠精神分裂模型的認(rèn)知情況

首先對(duì)實(shí)驗(yàn)中的兩組大鼠進(jìn)行精神分裂模型檢測(cè)，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。采用Sams-Dodd刻板行為評(píng)分系統(tǒng)對(duì)兩組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，根據(jù)大鼠的好動(dòng)性和動(dòng)態(tài)幅度大小在1～5分之間對(duì)大鼠行為進(jìn)行打分計(jì)算；另外再用曠場(chǎng)實(shí)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)大鼠精神分裂模型建模成功與否，在誘導(dǎo)組給藥7 d后，將誘導(dǎo)組和對(duì)照組放入約10 mm2的房間，地板劃分40個(gè)等大方格，在封閉無(wú)其他因素影響的條件下記錄兩組大鼠的活動(dòng)情況，并記錄大鼠的活動(dòng)的方格數(shù)，用大鼠穿越方格的數(shù)量來(lái)反映活動(dòng)情況。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)分別單獨(dú)進(jìn)行，且條件相同。

1.2.4 蘇木精-伊紅染色病理學(xué)觀察兩組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核固縮陽(yáng)性率[13]

麻醉處死大鼠后解剖取樣，將前額葉組織置于10%的福爾馬林溶液中，保持細(xì)胞原有形態(tài)。將修剪后的樣本置于包埋盒中沖洗0.5 h后用一定濃度梯度的酒精進(jìn)行脫水處理，然后用石蠟包埋，切成5 μm厚度的切片，烘干后進(jìn)行HE染色。使用明視場(chǎng)顯微鏡(Olympus BX61，日本Olympus公司)和掃描共聚焦激光顯微鏡(FV1000；日本Olympus公司)檢查所有樣品并拍照。通過(guò)待分析區(qū)域的組織切片的z軸收集10堆0.5 μm厚的光學(xué)切片顯微鏡下進(jìn)行鏡檢觀察大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核固縮陽(yáng)性率情況，比對(duì)兩組大鼠細(xì)胞受損度。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定大鼠血液中的蛋白激酶A的含量

使用小鼠PKA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒測(cè)定大鼠血液中的蛋白激酶A的含量。兩組實(shí)驗(yàn)大鼠在空腹12個(gè)小時(shí)后進(jìn)行麻醉舌下靜脈取血，處死后對(duì)大鼠腦補(bǔ)進(jìn)行解剖留樣，用于后面病理切片觀察。應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或作為抗凝劑，然后加入10%(v/v)抗凝劑(0.1 mol/L檸檬酸鈉或1% heparin 或2.0% EDTA-Na2)混合大約15 min后，在(3000 r/min)離心機(jī)下離心20 min，收集樣本上清液。然后將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，加如樣品時(shí)時(shí)間控制在15 min內(nèi)。然后進(jìn)行室溫溫育、洗滌。加入底物后定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。利用小鼠(趨化因子/CCL5)試劑盒檢測(cè)兩組實(shí)驗(yàn)大鼠中的CCL5水平含量。同檢測(cè)蛋白激酶A方法類似，靜脈舌下取血液樣本，經(jīng)過(guò)離心取樣、稀釋、加樣、溫育、洗滌等步驟，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸分析計(jì)算濃度。

1.2.6 凝膠電泳和Western印跡分析

同樣靜脈抽取兩組大鼠舌下血液樣本，然后離心稀釋，將離心樣本放置于100 μL緩沖液(50 mmol/L HEPES，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA， 1% Triton X-100，50 mmol/L氟化鈉，5 mmol/L焦磷酸鈉)中。 β-甘油磷酸鈉，1 mmol/L鄰釩酸鈉，1 mmol/L二硫蘇糖醇，1 mmol/L苯基甲磺酰氟，10 μg/ mL亮抑酶肽，10 μg/ mL抑肽酶)。通過(guò)BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce，Rockford，IL)測(cè)定全細(xì)胞提取物的含量。加入10μg樣品并在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離。轉(zhuǎn)移后對(duì)于Hybond ECL，硝酸纖維素膜(Amersham Pharmacia生物技術(shù)公司，美國(guó))在4℃下用5%牛血清白蛋白封閉過(guò)夜處理，然后用指示的抗體探測(cè)。使用適當(dāng)?shù)拿庖咔虻鞍自噭┩ㄟ^(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(Amersham Pharmacia生物技術(shù)公司，美國(guó))觀察印跡。

1.2.7 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

將1 μg經(jīng)DNA酶處理的RNA等分試樣與1 μL oligo dT引物(0.5 mg/mL)，1 μL 10 mm dNTP和ddH2O混合以均衡所有體積樣品濃度為12 μL。將混合物在65℃加熱5 min，在冰上淬滅并短暫旋轉(zhuǎn)，然后加入8 μL由4 μL 5×第一鏈緩沖液(Invitrogen)，2 μL 0.1 mol/L DTT組成的Master Mix，1 μL RNase抑制劑(Invitrogen公司，美國(guó))和1 μL Superscript II(200 μL/μL，Invitrogen)。將反應(yīng)在42℃下孵育60 min，然后在70℃下孵育15 min，然后進(jìn)行4℃浸泡。向每個(gè)樣品(在20 μL總體積中)中加入80 μL ddH2O。將5 μL稀釋的cDNA用于25 μL體積的每個(gè)PCR反應(yīng)，以下引物用于小鼠CCL5 cDNA和PKA的PCR擴(kuò)增。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.8 RT-qPCR分析mRNA的表達(dá)

為了通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR(RT-qPCR)確定mRNA表達(dá)水平，根據(jù)制造商的方案,稀釋并以幾種不同濃度研究1 μg總RNA轉(zhuǎn)化的cDNA樣品。將稀釋的cDNA與靶向小鼠CCL5、PKA或GAPDHcDNA序列的一對(duì)引物(10 μmol/L)混合，如上所述，并與15 μL體積的SYBR green PCR master mix(Applied Biosystems，CA)混合。 PCR循環(huán)如下：在50℃下2 min，在95℃下10 min進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，然后在15℃下在95℃下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在60℃下進(jìn)行1 min進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠刻板行為評(píng)分和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分

誘導(dǎo)組與對(duì)照組大鼠相比刻板行為評(píng)分和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明用苯丙胺誘導(dǎo)的大鼠精神分裂模型建模成功。(表2)

2.2 前額葉皮質(zhì)蘇木精-伊紅染色

誘導(dǎo)組較對(duì)照組細(xì)胞陽(yáng)性率占比高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。誘導(dǎo)組前額葉椎體細(xì)胞大量核固縮，箭頭指向代表固縮現(xiàn)象。胞漿嗜伊紅染色增強(qiáng)，胞膜與周圍分界清楚，對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組此現(xiàn)象。(圖1，表3)

2.3 PKA和CCL5 mRNA表達(dá)

與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組大鼠PKA和CCL5 mRNA表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖2，表4)

2.4 PKA和CCL5蛋白含量檢測(cè)

誘導(dǎo)組大鼠體內(nèi)PKA和CCL5含量與對(duì)照組相比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(表5)

2.5 白細(xì)胞介素(IL-1α、IL-1β和IL-17)的蛋白表達(dá)檢測(cè)

誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比IL-1α、IL-1β和IL-17的蛋白表達(dá)均增加，促炎反應(yīng)加強(qiáng)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖3，表6)

表2 大鼠刻板行為評(píng)分和曠場(chǎng)試驗(yàn)評(píng)分

圖1 前額皮質(zhì)的病理學(xué)改變(蘇木精-伊紅染色)(×200)Figure 1 Pathological changes of the rat prefrontal cortex tissues. Hematoxylin-eosin staining

表3 核固縮細(xì)胞陽(yáng)性率占比

表4 PKA和CCL5基因mRNA表達(dá)量

圖2 RT-qPCR檢測(cè)PKA和CCL5 mRNA表達(dá)Figure 2 RT-q PCR for detection of PKA and CCL5 gene expressions

組別GroupsPKA(mmol/g)CCL5(mmol/g)對(duì)照組Control group2.46±0.671.35±0.24誘導(dǎo)組Induced group4.21±1.053.76±0.51t5.2213.268P0.0050.021

圖3 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)白細(xì)胞介素相關(guān)蛋白Figure 3 Detection of interleukin-related proteins by Western blotting

組別GroupsIL-1αIL-1βIL-17對(duì)照組Control group1.02±0.170.94±0.131.05±0.25誘導(dǎo)組Induced group2.85±0.352.15±0.272.16±0.32t6.7618.6435.238P0.0260.0150.003

3 討論

精神疾病是全球最普遍和最致殘的疾病之一。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2030年，精神疾病將成為全球疾病負(fù)擔(dān)的主要原因。近年來(lái)，這些病癥的臨床管理幾乎沒(méi)有改善，因?yàn)榕R床醫(yī)生受到當(dāng)前藥物制劑的次優(yōu)效果和主觀現(xiàn)象學(xué)診斷范例的阻礙，對(duì)這些疾病的發(fā)病機(jī)制和病理生理學(xué)機(jī)制的深入理解有可能為這些疾病的治療提供改進(jìn)的治療和診斷工具[14]。細(xì)胞因子和這種神經(jīng)免疫軸的炎癥方面已經(jīng)得到了最深入的研究，然而調(diào)節(jié)這些方面的轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用迄今還沒(méi)有取得很大進(jìn)展[15-16]。其他研究途徑也開(kāi)始探索適應(yīng)性免疫細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在其中的作用。目前，在這些研究中相對(duì)忽略了被稱為趨化因子的免疫蛋白，最近有證據(jù)表明這些蛋白質(zhì)可能在與精神疾病相關(guān)的神經(jīng)免疫過(guò)程中起關(guān)鍵作用[17]。包括以前未被認(rèn)識(shí)的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑效應(yīng)，直接神經(jīng)遞質(zhì)樣作用，神經(jīng)內(nèi)分泌軸的調(diào)節(jié)，血腦屏障滲透性的控制，神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)，神經(jīng)保護(hù)作用以及軸突傳遞和伸長(zhǎng)的調(diào)節(jié)[18]。

本研究通過(guò)大鼠刻板行為評(píng)分為和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組與對(duì)照組大鼠相比刻板行為評(píng)分和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)均升高，這表明用苯丙胺誘導(dǎo)的大鼠精神分裂模型建模成功。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃u(píng)估前額葉皮質(zhì)區(qū)PKA和CCL5在精神分裂癥疾病中表達(dá)變化情況。早期證據(jù)表明趨化因子可能在精神分裂樣本中被上調(diào)。該研究發(fā)現(xiàn)血漿CCL5在精神分裂疾病中增加，CCL5 mRNA和蛋白質(zhì)在精神分裂模型前額葉組織的腦微血管系統(tǒng)中以更高水平表達(dá)，這可能與作為支持滲透的趨化因子相關(guān)。大多數(shù)已發(fā)表的研究，包括測(cè)量這些精神疾病中的趨化因子，都涉及到炎癥性趨化因子CCL5[19]。因此，未來(lái)的工作應(yīng)該考慮除炎癥過(guò)程中涉及的其他趨化因子的測(cè)量。本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組前額葉椎體細(xì)胞大量核固縮，箭頭指向代表固縮現(xiàn)象。胞漿嗜伊紅染色增強(qiáng)，胞膜與周圍分界清楚，對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組此現(xiàn)象。本研究的行為和病理反映損傷反映大鼠精神分裂模型認(rèn)知功能發(fā)生障礙，其原因與前額葉椎體細(xì)胞大量核固縮死亡有關(guān)。

本研究生化研究的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組大鼠PKA和CCL5 mRNA表達(dá)量升高；誘導(dǎo)組大鼠體內(nèi)PKA和CCL5含量與對(duì)照組相比升高；誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比IL-1α、IL-1β和IL-17的蛋白表達(dá)均增加，促炎反應(yīng)加強(qiáng)；誘導(dǎo)組較對(duì)照組細(xì)胞陽(yáng)性率占比高。這說(shuō)明，趨化因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多炎癥或感染性疾病中高度表達(dá)，包括多發(fā)性硬化，實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏腦脊髓炎，阿爾茨海默病，精神分裂性疾病病等[20]。盡管在這些病變中檢測(cè)到幾種促炎介質(zhì)，但已顯示趨化因子可刺激神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生這些其他介質(zhì)。趨化因子降低神經(jīng)性細(xì)胞內(nèi)cAMP水平和PKA活性通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶從細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生環(huán)狀A(yù)MP，腺苷酸環(huán)化酶是一種膜結(jié)合酶，其對(duì)G蛋白活化的敏感性不同。本研究中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)精神分裂癥實(shí)驗(yàn)大鼠中的PKA和CCL5含量水平、蛋白表達(dá)都比正常組大鼠的高，說(shuō)明精神分裂癥狀的前額葉神經(jīng)細(xì)胞受到里不同程度的損傷。其中檢測(cè)到白細(xì)胞介素(IL-1α、IL-1β和IL-17)的表達(dá)升高進(jìn)一步表明誘導(dǎo)組的炎癥反應(yīng)加重。

綜上所述，精神分裂癥大鼠模型中前額葉椎體細(xì)胞大量核固縮，胞漿嗜伊紅染色增強(qiáng)，前額葉皮質(zhì)PKA和CCL5都有相應(yīng)的高表達(dá)，增加炎癥反應(yīng)發(fā)生，在藥物處理上可針對(duì)這兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行靶向治療。