湯 琦，施 磊，鄭 璐，代琴芳，陳小川

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715)

口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)是目前評(píng)價(jià)機(jī)體糖代謝狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)之一，同時(shí)也是評(píng)價(jià)機(jī)體胰島β細(xì)胞功能的常用方法[1]。為了使胃充分排空，其中比較關(guān)鍵的一步是禁食，但過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短時(shí)間禁食對(duì)機(jī)體存在潛在的影響，使得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理狀態(tài)出現(xiàn)差別[2-3]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的饑餓感，影響正常的糖代謝，胰島素敏感性下降，出現(xiàn)胰島素抵抗，在OGTT中更容易出現(xiàn)高血糖現(xiàn)象[4]；禁食時(shí)間過(guò)短，胃內(nèi)容物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。因此，值得進(jìn)一步研究和探討實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在OGTT中最佳禁食時(shí)間。大鼠的糖耐受實(shí)驗(yàn)禁食時(shí)間有較系統(tǒng)的研究，為10～12 h，在小鼠的諸多糖耐量實(shí)驗(yàn)中，禁食時(shí)間并不統(tǒng)一。有人選擇4、6、8 h作為禁食[5]，但大部分普遍選擇10～12 h為禁食時(shí)間[6-10]，最長(zhǎng)禁食時(shí)間也有14～16 h[11-12]；國(guó)外對(duì)雄性C57BL/6J小鼠有較系統(tǒng)的研究，選擇禁食0、3、6、24 h，在OGTT中禁食6 h是評(píng)估糖耐受的最佳方法[13]。但6～24 h之間跨度較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異大、分辨率不高，實(shí)驗(yàn)條件也不統(tǒng)一，沒(méi)有很強(qiáng)的說(shuō)服力。所以有必要在小鼠的品種、性別、年齡、體重、胰島素抵抗、實(shí)驗(yàn)環(huán)境等多種影響因素同一的條件下對(duì)小鼠OGTT進(jìn)行系統(tǒng)、詳細(xì)的研究，可以更好地優(yōu)化OGTT禁食方案。

小鼠具有各種不同基因背景的近交品系、突變品系和封閉群，為研究提供了多種動(dòng)物模型選擇。已有許多文獻(xiàn)表明不同基因背景小鼠的糖代謝、脂代謝能力都有明顯差異[14-16]，因此選擇合適的品系作為研究對(duì)象就顯得十分重要。糖尿病模型大部分是采用 C57BL/6J小鼠[17]，但現(xiàn)有的糖尿病模型新進(jìn)展顯示，C57BL/6J品系小鼠可能并不是糖尿病模型的理想動(dòng)物[18]，該品系小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較高，成模率、死亡率和昆明小鼠基本一致[19]，因此昆明小鼠是較C57BL/6J小鼠更為經(jīng)濟(jì)有效的建立糖尿病模型的小鼠品系[19]。C57BL/6J小鼠在OGTT中的禁食時(shí)間國(guó)外有較為系統(tǒng)的研究，但昆明小鼠沒(méi)有比較系統(tǒng)的研究。昆明小鼠是我國(guó)生產(chǎn)量、使用量最大的遠(yuǎn)交群小鼠，它在我國(guó)生物醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中約為小鼠總用量的70%[20]。因此，研究人員參考了國(guó)外C57小鼠的案例，在昆明鼠上進(jìn)行進(jìn)一步研究和探討。

一些研究表明，性別差異會(huì)影響體重、葡萄糖耐受、空腹血糖和胰島素水平[21- 22]，40日齡雄性昆明小鼠的血糖和胰島素水平上升更為顯著，生化結(jié)果穩(wěn)定可靠[23-24]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用四組6～7周齡的雄性昆明小鼠，通過(guò)分別禁食4、8、10、12 h，利用OGTT比較每組昆明小鼠血糖濃度、胰島素濃度、空腹血糖濃度值與胰島素濃度值比值的差異，分析不同禁食時(shí)間后昆明小鼠血糖濃度和胰島素濃度的變化。初步探討禁食時(shí)間對(duì)昆明小鼠糖耐量和葡萄糖刺激胰島素分泌的影響，探尋比較合理的禁食時(shí)間。為昆明小鼠進(jìn)行OGTT時(shí)提供科學(xué)的禁食時(shí)間的參考，也可在采用昆明小鼠建立糖尿病模型時(shí)，糖耐量實(shí)驗(yàn)的禁食時(shí)間提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5～6周齡清潔級(jí)昆明雄性小鼠16只，體重31～34 g，由重慶市中藥研究所提供[SCXK(渝) 2012-0006]，飼養(yǎng)在國(guó)家級(jí)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心[SYXK(渝) 2012- 0003]。小鼠每四只飼養(yǎng)于籠中(30 cm × 15 cm × 20 cm)，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，飼以標(biāo)準(zhǔn)鼠料(重慶市中藥所，重慶)，自由進(jìn)食和飲水。室內(nèi)溫度為(28 ± 1)℃，光照16 L∶8 D，濕度為40% ～ 60%。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天小鼠隨機(jī)分為 4 組，每組4只，然后分別禁食4、8、10、12 h，禁食時(shí)去除籠中的墊料和鼠料，只留充足的飲水。動(dòng)物使用的倫理審批號(hào)(IACUC)為No. [2007] 3，實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

葡萄糖(上海生工生物工程公司)，血糖試紙(美國(guó)Roche公司)，超敏小鼠胰島素酶免試劑盒(易致生物科技有限公司)，血糖儀(羅氏，美國(guó))，冷凍離心機(jī)(Eppendorf AG，德國(guó))，酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

禁食后，稱取小鼠體重，然后將小鼠固定于固定器上，再斷尾處理(約2 mm)。棄去兩滴血后，采用血糖儀檢測(cè)血糖濃度；緊接著使用抗凝血槍頭(肝素鈉處理)的移液槍尾尖采血70 ～ 100 μL。將上述采集的血樣用離心機(jī)在4℃、3000 r/min條件下離心20 min，然后將血漿移至另一滅菌離心管中，放置冷凍盒上，以備隨后胰島素檢測(cè)。之后葡萄糖按1.5 mg/g灌胃(8號(hào)灌胃針)，每只小鼠應(yīng)當(dāng)灌胃的葡萄糖體積(μL)=10 × 小鼠體重(g)，灌胃后立即記為0 min。隨后的15、30、60、90 min測(cè)血糖濃度并尾尖采血。

1.3.2 小鼠血漿胰島素濃度測(cè)定

將上述采集的血樣用超敏小鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胰島素濃度。先用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋倍比標(biāo)準(zhǔn)品，接著加樣、封板、37℃溫育30 min；隨后配洗滌液，洗板后加酶標(biāo)試劑，37℃溫育30 min；然后洗板后加入顯色劑，37℃避光顯色15 min；最后加入終止液，在15 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)讀出OD值。試劑盒批間和批內(nèi)檢測(cè)精密度變異系數(shù)均小于10%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重

禁食完成后，稱量昆明小鼠體重，總體平均體重在(33.97 ± 2.61)g之間，各組小鼠體重沒(méi)有差異，見(jiàn)表1。

2.2 不同禁食時(shí)間對(duì)小鼠血糖的影響

小鼠禁食后，隨著禁食時(shí)間的延長(zhǎng)，各組小鼠空腹血糖值逐漸降低，禁食8、10、12 h組小鼠空腹血糖分別低于禁食4 h組小鼠空腹血糖40%、56%、79%(P< 0.01)(圖1A)。葡萄糖灌胃后，每組小鼠血糖立即升高，15 min時(shí)禁食4 h小鼠血糖比禁食10 h小鼠高5%，比禁食8、12 h小鼠血糖均高23%。30 min時(shí)各組小鼠血糖值均達(dá)到最高點(diǎn)，禁食12 h小鼠血糖低于其他三組15%左右；與0 min相比，30 min時(shí)禁食4、8、10、12 h小鼠血糖升高61%、73%、75%、74%，禁食10 h血糖上升幅度最大。30 min后血糖逐漸下降，90 min時(shí)各組小鼠血糖值均恢復(fù)到初始水平，各組小鼠血糖無(wú)差異(圖1B)。通過(guò)曲線下面積分析，禁食10 h小鼠血糖曲線下面積最大，比禁食4 h小鼠血糖曲線下面積高31%(P< 0.05)，比禁食8、12 h小鼠分別高16%、17%(圖1 C)。

2.3 不同禁食時(shí)間對(duì)小鼠胰島素的影響

隨著禁食時(shí)間的延長(zhǎng)，各組小鼠空腹胰島素都逐漸降低，禁食4 h的空腹胰島素比禁食8 h高4%，大約是禁食12 h空腹胰島素的兩倍(圖2A)。在灌胃之后，小鼠胰島素含量立即升高，在15 min采血點(diǎn)上其含量最高，禁食4 h組的15 min胰島素比0 min胰島素高66%，比禁食8、10、12 h小鼠分別高60%、67%、71%。隨后胰島素下降迅速，大約在60 min降至基準(zhǔn)值，禁食10 h小鼠下降幅度最大，比15 min最高點(diǎn)下降了65%；禁食12 h小鼠下降幅度最小，為46%(圖2B)。禁食4 h組的胰島素曲線下面積比其他三組分別高30%、34%、31%(圖2C)。

2.4 不同禁食時(shí)間的空腹血糖與胰島素比值

空腹血糖與血漿胰島素的比值可作為最簡(jiǎn)便的胰島素抵抗指標(biāo)[25]。通過(guò)空腹血糖與血漿胰島素的比值分析，昆明小鼠在OGTT前禁食4、8、10、12 h，沒(méi)有改變胰島素抵抗，總體平均值無(wú)顯著差異。(圖3)。

表1 小鼠體重變化

圖1 不同禁食時(shí)間對(duì)小鼠血糖的影響Figure 1 Effects of different fasting time on blood glucose in the mice

圖2 不同禁食時(shí)間對(duì)小鼠胰島素的影響Figure 2 Effects of different fasting time on the insulin in mice

圖3 不同禁食時(shí)間的空腹血糖與胰島素比值Figure 3 Fasting blood glucose and insulin ratio with different fasting time

3 討論

糖耐受實(shí)驗(yàn)已成為檢測(cè)血糖耐受和胰島素分泌最廣泛應(yīng)用的生理測(cè)試之一，實(shí)驗(yàn)前禁食時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響；小鼠作為糖耐受實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，其品種、性別、年齡、體重、禁食時(shí)間等諸多因素的不同一，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會(huì)有一定差異。本實(shí)驗(yàn)在同一實(shí)驗(yàn)條件下，針對(duì)禁食時(shí)間研究發(fā)現(xiàn)，昆明小鼠在OGTT中禁食8～10 h是比較合理的禁食范圍，糖耐受血糖變化差異大，胰島素分泌較好，為昆明小鼠進(jìn)行OGTT時(shí)提供科學(xué)的禁食時(shí)間的參考。

大量的研究表明外周組織會(huì)使胰島素敏感性下降，使外周攝取葡萄糖降低，導(dǎo)致胰島素抵抗[26]。在本實(shí)驗(yàn)中，昆明小鼠的體重為(33.97 ± 2.61)g，符合同年齡段昆明小鼠正常體重(35.26 ± 2.80)g[27]。禁食4、8、10、12 h后，小鼠各組空腹血糖值與空腹胰島素值的比值無(wú)顯著差異，總體平均值無(wú)顯著差異，說(shuō)明禁食后沒(méi)有改變昆明小鼠胰島素敏感性，所有小鼠胰島素敏感性都保持一致。因此，本實(shí)驗(yàn)在同一的條件下，只針對(duì)禁食時(shí)間對(duì)昆明小鼠糖耐受的影響進(jìn)行研究。

禁食會(huì)降低體內(nèi)糖原和乳酸含量[25]，對(duì)糖代謝產(chǎn)生影響。不同禁食時(shí)間對(duì)小鼠的空腹血糖調(diào)節(jié)會(huì)產(chǎn)生一定影響[13]，禁食8、10、12 h小鼠空腹血糖濃度分別低于禁食4 h小鼠空腹血糖濃度40%、56%、79%，與前人研究結(jié)果一致[28]。禁食時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使小鼠可利用能量減少[25]，導(dǎo)致血糖濃度降低。隨著禁食時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠血糖濃度下降緩慢，各個(gè)禁食時(shí)間段的空腹血糖濃度都有一定的浮動(dòng)，血糖的這種變化主要與小鼠的禁食時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，不同的血糖變化趨勢(shì)可能表明不同禁食時(shí)間對(duì)昆明小鼠胰島素的敏感性不同。葡萄糖灌胃后，各組小鼠血糖均升高，30 min時(shí)各組小鼠血糖值均達(dá)到最高點(diǎn)。與0 min相比，禁食10 h血糖上升75%，上升幅度最大，血糖分辨率高。通過(guò)分析血糖曲線下面積發(fā)現(xiàn)，禁食10 h組的血糖曲線下面積最大。

在禁食狀態(tài)下血液中胰島素含量維持在基準(zhǔn)水平[29]，禁食8 h小鼠的空腹胰島素濃度比禁食4 h組小鼠低4%，而比禁食10 h組小高40%，大約是禁食12 h空腹胰島素濃度的兩倍。葡萄糖灌胃之后，小鼠胰島素含量立即升高，禁食8 h胰島素濃度上升幅度最小，其他三個(gè)禁食組胰島素濃度上升幅度基本一致，昆明小鼠禁食8 h，糖耐量胰島素處于較低水平。從胰島素曲線下面積看，禁食8、10、12 h小鼠胰島素曲線下面積基本一致，比禁食4 h小鼠分別低30%、34%、31%，禁食8 h小鼠的胰島素曲線下面積最小。在整個(gè)糖耐受中，禁食8 h小鼠的胰島素濃度和禁食4 h小鼠的胰島素濃度較為一致，但禁食8 h小鼠胰島素濃度曲線下面積低于禁食4 h小鼠。由此來(lái)看，禁食8 h左右小鼠胰島素分泌量較少，對(duì)血糖調(diào)節(jié)效率高。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在同一條件下，對(duì)四組昆明小鼠分別進(jìn)行4、8、10、12 h的禁食，通過(guò)OGTT分析血糖濃度、胰島素濃度、空腹血糖值與空腹胰島素值的比值發(fā)現(xiàn)，禁食8～10 h的昆明小鼠，葡萄糖刺激后，血糖變化趨勢(shì)較好，分辨率高，胰島素分泌量較好，在OGTT中可作為比較合理、有效、可靠的禁食時(shí)間。