殷張昕， 高彤彤， 莊紫薇， 鐘曉宇， 李季穗，王文波， 姜科聲， 胡一中， 徐曉虹

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

0 引 言

BPA是酚類化合物中具有代表性的一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,因其可以改進塑料制品的可塑性和拉伸性而大量應用于生產(chǎn)碳酸聚酯、環(huán)氧樹脂類食品飲料包裝材料、醫(yī)療用品和日常用品,導致人們和野生動物的終生BPA暴露風險.2008年美國健康食品安全檢查報告調(diào)查2 517人中有92.6%的尿液檢出BPA,兒童和青少年體內(nèi)BPA含量更高[1].BPA的化學結(jié)構(gòu)類似己烯雌酚,可與ER結(jié)合而表現(xiàn)出弱雌激素活性，從而干擾內(nèi)源性激素對機體生理活動的調(diào)節(jié),對人類和野生動物的生殖和發(fā)育產(chǎn)生危害[1-2].據(jù)此,歐美制定了人群BPA的最低容許攝入量為50 μg·kg-1·d-1.然而,近十多年的研究發(fā)現(xiàn),低劑量BPA(<50 μg·kg-1·d-1)可影響人和動物的腦和行為發(fā)育[3-5].出生早期BPA暴露可引起雌性大鼠青春期提前[6],妊娠期BPA暴露加重青春期仔鼠的焦慮和抑郁樣狀態(tài)[7],并消除焦慮和抑郁行為的性別差異[8-9],還可影響腦內(nèi)神經(jīng)元突觸發(fā)育[10].

青春期是腦發(fā)育和社會認知形成的關(guān)鍵時期,此時開始發(fā)育的性腺分泌性激素,對社會行為的神經(jīng)環(huán)路成熟和功能起激活作用,對社會行為的形成及其性別分化非常重要[11].社會玩耍是最早發(fā)生于非母親指向的幼年至青春期同種個體間的社會行為,有利于個體社會技能和認知功能發(fā)育.早期社會隔離和玩耍剝奪會減少青少年社會動機,使成年后社會互作減少,攻擊行為增加,并影響性行為[12].社會行為異常還是早期精神發(fā)育障礙的主要癥狀,自閉癥和早發(fā)性精神分裂癥患者在兒童至青春期即表現(xiàn)出社會玩耍和社會互作減少[13].青春期性激素對社會行為神經(jīng)環(huán)路成熟和功能激活的重要作用,使青春期的腦對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物非常敏感[14].流行病學研究發(fā)現(xiàn),出生前后BPA暴露導致兒童攻擊、注意缺陷、多動障礙、焦慮和抑郁等多種精神和情緒異常[15].因此,推測青春期暴露于BPA很有可能影響雌性動物的社會行為,但目前國內(nèi)外還沒有相關(guān)報道.本文探討了青春期BPA暴露對雌鼠情緒和社會行為的影響,并分析是否與DA遞質(zhì)系統(tǒng)活動的改變有關(guān).

1 材料和方法

1.1 實驗動物、模型制備與分組

3周齡ICR雌性小鼠購于浙江省醫(yī)學科學院動物中心,常規(guī)飼養(yǎng)適應1周后,參考人群日常暴露水平,設(shè)3個BPA暴露組:0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1(根據(jù)體表面積藥理劑量換算相當于人體暴露水平:3.24,32.4,324 μg·kg-1·d-1)和溶媒對照組(油).每天灌胃染毒BPA連續(xù)3周,制備青春期BPA暴露模型.每組小鼠分2籠飼養(yǎng).在8周齡(青年期)時,每組隨機從各籠中取12只小鼠進行行為檢測(n=12),另取未進行行為測試的8只小鼠眼眶取血,酶聯(lián)免疫分析法檢測小鼠腦和血清雌二醇(estradiol,E2)水平(n=8),取6只小鼠提取腦紋狀體組織用于蛋白表達檢測(n=6),最后分離子宮稱重,計算子宮系數(shù)(子宮質(zhì)量/體質(zhì)量).

1.2 行為測試

行為測試按以下順序進行.整個過程用小動物行為分析系統(tǒng)(德國TSE 系統(tǒng)股份有限公司)記錄.每一行為結(jié)束后,隔天進行下一個行為檢測.每只小鼠測試后用75%乙醇擦拭模型,防止氣味影響下一個動物的行為.所有行為由小動物行為分析系統(tǒng)自動監(jiān)測記錄,并由經(jīng)過訓練的人員采用雙盲法采集和分析數(shù)據(jù).

采用曠場行為[16]記錄小鼠5 min內(nèi)的跑動穿越格數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間、站立和理毛次數(shù)(n=12).其中,跑動格數(shù)反映動物在新異環(huán)境中的自發(fā)活動性,站立次數(shù)反映動物的探究意愿,中央?yún)^(qū)停留時間反映焦慮狀態(tài).

采用社會玩耍行為[16]記錄15 min內(nèi)2只相同年齡和處理的陌生小鼠互相爬跨、追逐、打斗、理毛和嗅探等玩耍指標,其中互相理毛和嗅探作為社會探索(n=12)[17].

采用三室模型[16]記錄5 min內(nèi)待測小鼠分別在含陌生鼠圓筒或含空圓筒的隔間所停留時間，以及對陌生鼠或空圓筒的嗅探時間來檢測小鼠的社會交互能力(n=12).測試小鼠在含陌生鼠隔間停留或嗅探陌生鼠的時間越長,社會交互能力越強[18].

采用高架十字迷宮[16]記錄5 min內(nèi)動物在開放臂的停留時間來評價焦慮情緒,中央?yún)^(qū)探頭次數(shù)反映動物的探究意愿(n=12).

采用強迫游泳模型[16]檢測動物的習得性無助而評價其抑郁狀態(tài)[19].記錄小鼠從游泳開始至出現(xiàn)第1次靜止不動的時間記為潛伏期;記錄6 min強迫游泳期的后4 min內(nèi)小鼠靜止不動的總時間.靜止不動的潛伏期越短或靜止不動總時間越長表示抑郁越嚴重(n=12).

1.3 Western Blot檢測紋狀體組織ERβ，DAT和 DR1蛋白表達水平

小鼠(8周齡)斷頸處死后取腦,4 ℃分離雙側(cè)紋狀體組織,制備蛋白樣品分裝,-20 ℃保存?zhèn)溆?n=6).取10～20 μL蛋白樣品SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC)上,封閉,分別加相應一抗(β-actin(1∶1 000),ER-β(1∶400),DAT(1∶500),DR1(1∶600))孵育,漂洗,再將NC膜與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗孵育,漂洗,用免疫化學發(fā)光試劑顯色,X片曝光后顯影、掃描,Quantity One軟件半定量分析蛋白條帶光密度.

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用平均值±標準誤差(M±SE)表示,采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件通過單因素方差分析不同劑量BPA暴露的作用,進行Post-hoc 測試后LSD檢驗,P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 青春期BPA暴露對雌鼠生長發(fā)育的影響

青春期0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露沒有明顯改變青年雌鼠體質(zhì)量和子宮系數(shù),提示青春期低劑量BPA暴露對小鼠的生長和生殖器官發(fā)育沒有明顯影響(見表1).

表1 BPA對雌鼠體質(zhì)量和子宮系數(shù)的影響

2.2 青春期BPA暴露對雌鼠曠場行為的影響

4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少小鼠在曠場中懸空站立次數(shù)(P<0.05),0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少小鼠在中央?yún)^(qū)的停留時間(P<0.05),提示青春期BPA暴露顯著降低小鼠的探究意愿,并提高其焦慮狀態(tài)(見表2).

表2 青年雌鼠的曠場行為(n=12)

注：與對照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05).

2.3 青春期BPA暴露對雌鼠高架十字迷宮和強迫游泳行為的影響

高架十字迷宮行為測試結(jié)果顯示,青春期0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露顯著縮短小鼠在開放臂的停留時間(P<0.01,P<0.05),延長其在封閉臂的停留時間(P<0.05),0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少小鼠中央?yún)^(qū)探頭次數(shù)(均為P<0.05)(見表3).強迫游泳測試結(jié)果顯示,0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著了縮短小鼠強迫游泳時第1次靜止不動的潛伏期(P<0.05)和增加了靜止不動的總時間(P<0.05)(見圖1a～b),提示青春期BPA暴露加重雌鼠的焦慮和抑郁樣情緒,降低了其探究的意愿.

表3 青年雌鼠的高架十字迷宮行為(n=12)

注：與對照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01).

2.4 青春期BPA暴露對雌鼠社會玩耍和社會交互能力的影響

社會玩耍行為測試中,青春期0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露顯著減少小鼠的社會玩耍時間(P<0.05),0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少社會探索時間(P<0.05,P<0.01)和探索頻率(4.00 mg·kg-1·d-1BPA，P<0.01);三室模型檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,BPA暴露雖然沒有明顯改變小鼠對陌生鼠或空圓筒的嗅探時間,但0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著降低了小鼠嗅探陌生鼠和嗅探空圓筒的時間比(P<0.05),提示青春期BPA暴露不僅顯著降低小鼠的社會玩耍能力,還減弱其社會探究意愿和社會交互能力(見表4).

表4 青年雌鼠的社會玩耍和社會交互能力(n=12)

注：與對照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01).

2.5 青春期BPA暴露對成年雌鼠紋狀體DAT和DR1表達的影響

鑒于紋狀體的DA遞質(zhì)系統(tǒng)在情緒和社會行為中的關(guān)鍵作用,實驗進一步分析了紋狀體DA轉(zhuǎn)運體(DAT)和DA的D1受體(DR1)蛋白表達水平.研究結(jié)果顯示,0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著上調(diào)DA轉(zhuǎn)運體(DAT)的表達水平(P<0.05，P<0.01),0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著上調(diào)DR1的表達水平(P<0.05，P<0.01)(見圖2a～b).

與對照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01)

2.6 青春期BPA暴露對青年雌鼠腦和血清雌激素水平以及紋狀體ERβ表達的影響

由于雌激素通過腦內(nèi)雌激素受體參與調(diào)節(jié)情緒和社會行為,而紋狀體又與情緒和社會行為密切相關(guān),實驗檢測了腦和血清的雌二醇水平,并用Western Blot分析了紋狀體ERβ蛋白表達.研究結(jié)果顯示,青春期0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露沒有明顯改變青年雌鼠腦和血清雌二醇水平(見圖3a～b),但0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著下調(diào)紋狀體ERβ表達水平(P<0.01)(見圖3c).

與對照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01)

3 討 論

青春期作為兒童到成年的一個過渡期,性腺開始發(fā)育,此時分泌的性激素對腦和行為發(fā)育至關(guān)重要.有人認為在出生前后,腦內(nèi)性激素主要調(diào)控行為相關(guān)神經(jīng)環(huán)路的形成;而在青春期,性激素對這些環(huán)路的成熟和功能起激活作用,是腦和行為發(fā)育的第2個關(guān)鍵期[11].因此,青春期的腦對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物很敏感.在動物的一生中,最早非母親指向的社會行為發(fā)生在幼年至青春期個體間的玩耍.社會玩耍從社會探究開始,表現(xiàn)為2只陌生小鼠通過相互嗅探熟悉對方,進行追逐、打斗、理毛和爬跨等玩?；顒?是社會交互的一種形式,也是個體融入社會的開始[17-18],對動物的生存和成年后的繁殖至關(guān)重要.

近年來動物研究發(fā)現(xiàn),宮內(nèi)暴露于BPA的青春期獼猴和小鼠與同性同伴的社會互動減少,該行為的性別差異被擾亂[20-21],圍生期BPA暴露減少青春期雌鼠的社會探究行為[22],但目前還不了解青春期BPA暴露對社會行為的影響,其機制更不清楚.實驗發(fā)現(xiàn),青春期BPA暴露顯著降低雌鼠的社會玩耍能力,并減少其相互嗅探和相互接觸等社會探索行為.同時在三室模型的陌生同伴和空圓筒的選擇中,一般動物更愿意與陌生同伴接觸,即具有一定的社會探究意愿.但青春期BPA暴露的雌鼠成年后接觸陌生鼠的時間有所縮短,而對空圓筒的接觸時間延長,明顯降低陌生鼠/空圓筒的嗅探時間比,表明青春期BPA暴露降低雌鼠成年后社會玩耍及社會探索意愿,減弱其社會互作能力.

情緒是影響動物社會行為的一個因素,焦慮和抑郁狀態(tài)的動物往往表現(xiàn)出較差的社會玩耍和社會交互能力.流行病學研究發(fā)現(xiàn),妊娠期母體尿液高BPA水平與3～12歲兒童表現(xiàn)出的高焦慮和抑郁情緒、及多動癥相關(guān)[23-24].出生前后BPA暴露的兒童還表現(xiàn)出攻擊行為、自閉癥等多種精神和情緒異?，F(xiàn)象[15].本研究結(jié)果顯示,0.40和4.00 mg·kg-1·d-1的BPA加重雌鼠在高架十字迷宮中的焦慮樣狀態(tài)和強迫游泳時的抑郁樣情緒,同時,這2個劑量的BPA降低小鼠的社會玩耍和社會交互能力,提示青春期BPA暴露導致的動物社會行為減弱可能與其加重的焦慮抑郁樣情緒有關(guān).

作為一種高級動機行為,社會行為具有獎賞價值,動物在與同伴、后代或性伴侶的社會互作中得到獎賞[25].因此,社會動機和獎賞是社會行為的動力.研究發(fā)現(xiàn),與高級動機行為相關(guān)的中腦腹側(cè)背蓋區(qū)-紋狀體的DA獎賞通路對社會行為發(fā)育至關(guān)重要[11].大鼠中腦神經(jīng)元DA合成限速酶、紋狀體DA受體密度均在青春期達到高峰后回落到成年水平,提示DA獎賞系統(tǒng)在青春期社會行為發(fā)育中的重要作用[4，11].Trezza等[25]發(fā)現(xiàn)社會玩耍伴隨著前腦和紋狀體DA水平升高,DA傳遞阻斷可減少社會玩耍,而Manduca等[26]發(fā)現(xiàn)注射DA再攝取抑制劑安非他命增加社會玩耍行為.筆者的實驗室發(fā)現(xiàn),0.40和4.00 mg·kg-1·d-1的BPA暴露上調(diào)紋狀體DAT表達水平.DAT是一種位于多巴胺能神經(jīng)元突觸前膜上的多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白,可將釋放至突觸間隙的多巴胺主動轉(zhuǎn)運再攝取回突觸前.BPA暴露導致DAT蛋白表達水平升高,加快對突觸間隙DA的移除而導致紋狀體突觸前DA能神經(jīng)纖維末梢DA傳遞效應減弱.同時,實驗發(fā)現(xiàn)BPA還上調(diào)紋狀體DA受體DR1表達水平.腦內(nèi)DR1被認為在社會行為中起重要作用,抑制紋狀體DR1可促進社會互作和社會探究等親社會行為[27].最近有報道表明，出生前后BPA暴露改變小鼠中腦DA系統(tǒng)和嗎啡獎賞活動[4],上調(diào)DA轉(zhuǎn)運體基因,上調(diào)邊緣前腦DR1而下調(diào)DR2[28],這與筆者的發(fā)現(xiàn)相一致.因此,青春期BPA暴露引起的紋狀體DA遞質(zhì)系統(tǒng)功能改變可能是其影響雌性動物社會行為異常的一個原因.

內(nèi)源性性激素對相關(guān)腦區(qū)的調(diào)節(jié)是青春期腦和行為發(fā)育性別差異的主要原因.給發(fā)育中的腦注射睪酮可使青春期雌鼠的玩耍行為雄性化,腦內(nèi)ER敲除的小鼠社會探究、攻擊和性行為均減少[11].實驗發(fā)現(xiàn),低劑量BPA暴露沒有明顯改變腦和血清的雌二醇水平,但是下調(diào)了與社會行為密切相關(guān)的紋狀體腦區(qū)ERβ蛋白表達.雌激素調(diào)節(jié)腦和行為主要通過ER介導,其中腦功能和非生殖相關(guān)行為主要由ERβ介導.在以往的研究中實驗室曾發(fā)現(xiàn),長期暴露BPA下調(diào)雌鼠ERβ水平[29].因此,青春期BPA暴露可能通過下調(diào)腦內(nèi)ERβ水平而抑制雌激素對社會行為的調(diào)節(jié).

4 結(jié) 論

綜上分析,青春期暴露于低劑量BPA可減少雌鼠社會玩耍,降低其社會探究意愿和社會互作能力.該作用可能與紋狀體腦區(qū)ERβ水平下調(diào)而干擾雌激素對相關(guān)腦區(qū)DA遞質(zhì)系統(tǒng)活動的調(diào)節(jié)有關(guān),最后導致社會行為改變.鑒于杏仁核和前額葉與焦慮抑郁情緒相關(guān),今后將進一步探討其在BPA影響情緒中的作用.本研究發(fā)現(xiàn)BPA影響社會行為和情緒的有效劑量為0.40,4.00 mg·kg-1·d-1,根據(jù)體表面積換算成人的藥理劑量為0.032 4，0.324 0 mg·kg-1·d-1,該劑量遠低于現(xiàn)有BPA的無不良效應極限值(50 mg·kg-1·d-1).因此,BPA對神經(jīng)行為發(fā)育的低劑量毒性作用應引起重視.