葛倩雯， 金寶花， 傅小進(jìn)， 顧志敏， 陳析豐， 馬伯軍

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.浙江師范大學(xué) 圖文信息中心，浙江 金華 321004)

葉片是植物光合作用的主要器官，合適的葉形態(tài)會(huì)增加植物的受光面積，促進(jìn)光合作用.在超級(jí)雜交稻株型模式中，袁隆平將水稻功能葉的形態(tài)歸結(jié)為“長(zhǎng)、直、窄、厚、凹”，其中“凹”是指葉片內(nèi)卷.適度的內(nèi)卷葉有助于葉片保持直立，改善群體生長(zhǎng)后期的受光條件，提高光透射率，提高水稻的產(chǎn)量[1].因此，研究植物的卷葉調(diào)控基因?qū)ψ魑锏纳a(chǎn)具有重要意義.

植物葉片卷曲的程度是受基因調(diào)控的，迄今在水稻中已經(jīng)克隆了13個(gè)卷葉調(diào)控基因[2].其中大部分基因通過(guò)影響泡狀細(xì)胞的大小及數(shù)量，參與葉片卷曲程度的調(diào)控，如RL14[3]，SRL1[4]，ADL1[5]，NAL7[6]，NRL1[7]，ROC5[8]，OsZHD1[9]，REL1[10]和ACL1[11]等.還有一部分基因通過(guò)影響維管束鞘延伸區(qū)和主脈薄壁細(xì)胞數(shù)量、維管束韌皮部的變化，導(dǎo)致葉片卷曲，如LC2[12]，CFL1[13]和SLL1[14]等.本研究從水稻誘變庫(kù)中篩選到一個(gè)典型的內(nèi)卷葉矮化突變體rld，并對(duì)該突變體進(jìn)行表型分析和基因定位，結(jié)合氨基酸序列與蛋白結(jié)構(gòu)分析確定該基因突變后引起卷葉突變表型的原因.為進(jìn)一步研究水稻葉片發(fā)育的分子機(jī)制提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻rld卷葉矮化突變體是從秈稻(OryzasativaL. ssp.indica)品種鎮(zhèn)恢084的60Co-γ輻射誘變庫(kù)中篩選獲得.以rld卷葉矮化突變體為母本與粳稻(OryzaSativaL. spp.japonica)野生型品種日本晴雜交，獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代.5月份，水稻種子37 ℃催芽2 d，將種子均勻點(diǎn)播于苗床上，30 d后插秧，常規(guī)大田管理.以上材料均種植于浙江省金華市水稻大田.

1.2 卷葉性狀測(cè)定方法

在成熟期，測(cè)量劍葉葉片最寬處自然卷曲狀態(tài)下葉緣間距(Ln)和展開后最寬處葉緣間距(Lw)，計(jì)算葉片卷曲度LRI=(Lw-Ln)/Lw×100%.

1.3 葉片的石蠟切片觀察

采用王承林[15]的方法進(jìn)行石蠟切片，取新鮮葉片，用FAA固定液體(V(福爾馬林)∶V(冰醋酸)∶V(70%乙醇)=1∶1∶18)固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，脫蠟、番紅、固綠染色，然后在顯微鏡下觀察、掃描成像.

1.4 卷葉矮化突變基因的遺傳分析

在成熟期，調(diào)查F1與F2群體的表型，統(tǒng)計(jì)F2群體中野生型和卷葉矮化突變型的單株數(shù)，采用χ2檢驗(yàn)分析F2群體中野生型與卷葉矮化突變型植株的分離比.

1.5 卷葉矮化突變基因的連鎖分析

采用群分法[16]進(jìn)行基因的連鎖分析.選取卷葉矮化突變體、野生型日本晴、F2群體中20株野生型單株和20株卷葉矮化突變型單株，采用Murray等[17]的方法分別提取葉片總DNA，并將20株野生型單株的DNA等量混合成野生池，將20株卷葉矮化突變型單株的DNA等量混合成突變池.用覆蓋水稻12條染色體的多態(tài)性SSR、Indel標(biāo)記[18-19]對(duì)卷葉矮化突變體、野生型日本晴，雜交F2代野生池和突變池的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR采用Taq PCR Master Mix試劑盒(南京博爾迪生物科技有限公司)，程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火(不同引物)30 s，72 ℃復(fù)性30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)EB染色后，在凝膠成像儀中掃描成像，篩選在野生池和突變池的PCR條帶之間具有多態(tài)的標(biāo)記，進(jìn)行目的基因的連鎖分析.

1.6 卷葉矮化突變基因的精細(xì)定位

在目的基因連鎖的染色體區(qū)段，尋找和設(shè)計(jì)更多的多態(tài)性SSR、Indel標(biāo)記(見表1).

表1 基因定位所用Indel標(biāo)記引物序列

擴(kuò)大定位群體的數(shù)目，選取F2群體中所有的卷葉矮化突變型單株，采用Murray等[17]的方法分別提取葉片總DNA，用多態(tài)性分子標(biāo)記按照1.5的PCR方法對(duì)每個(gè)單株進(jìn)行分析，檢測(cè)目的基因與分子標(biāo)記間的染色體重組率，將目的基因精細(xì)定位在2個(gè)緊密連鎖的標(biāo)記之間.

1.7 候選基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

采用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase試劑盒(TaKaRa)，50.0 μLPCR體系為：10.0 μL 5×PrimeSTAR緩沖液，4.0 μL dNTP混合物，2.0 μL 10 μmol/L引物(見表2)，2.0 μL模板DNA，0.5 μL PrimeSTAR HS DNA保真酶，31.5 μL無(wú)菌水.程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火5 s，72 ℃復(fù)性90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物委托生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序.

表2 候選基因PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 卷葉矮化突變體rld的表型特征

在水稻正常生長(zhǎng)條件下，從5葉期開始rld突變體的葉片沿主脈向內(nèi)卷曲成圓筒狀，之后葉片始終表現(xiàn)高度卷曲，在成熟期進(jìn)行測(cè)量，自然卷曲狀態(tài)下葉緣間距為(3.96±0.82) cm，展開后最寬處葉緣間距為(9.83±1.74) cm，葉片的卷曲度為59.7%.與野生型對(duì)照品種鎮(zhèn)恢084相比，rld突變體植株明顯矮小，發(fā)育遲緩且葉色加深，穂小而稀疏，結(jié)實(shí)率非常低，籽粒發(fā)育不良、畸形(見圖1).

a:水稻成熟期的植株；b:葉片；c:穗；d：籽粒

葉片組織的石蠟切片觀察表明，rld突變體葉片泡狀細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、數(shù)目與野生型對(duì)照沒有明顯的差異，但是維管束間下表皮細(xì)胞的面積明顯大于野生型對(duì)照(見圖2).

a：野生型鎮(zhèn)恢084葉片橫切面；b：rld突變體葉片橫切面；c：圖a放大部分；d：圖b放大部分(箭頭表示突變細(xì)胞)

2.2 卷葉矮化突變體rld的遺傳分析

用rld突變體做母本，與野生型日本晴雜交，其F1代植株均為野生型.F1代自交后獲得F2群體，F(xiàn)2植株的葉片出現(xiàn)野生型和卷葉矮化突變型，一共2 887個(gè)單株，其中2 195株為野生型，692株為卷葉矮化突變型.經(jīng)過(guò)χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)2群體中野生型與卷葉矮化突變型的比例為3∶1(χ2=1.23；P<0.05)，符合孟德爾遺傳.該結(jié)果表明rld突變體卷葉矮化性狀由一個(gè)隱性單基因控制.

2.3 卷葉矮化基因的連鎖分析和精細(xì)定位

用水稻中已公布的300多個(gè)SSR、Indel標(biāo)記對(duì)親本日本晴與rld突變體進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選到86個(gè)分布在12條染色體的多態(tài)SSR標(biāo)記.采用群分法進(jìn)行目的基因的連鎖分析，通過(guò)以上86個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)F2群體的野生型和突變型2個(gè)DNA混池進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)9號(hào)染色體上標(biāo)記R9M20與目的基因存在明顯的連鎖.

利用R9M20標(biāo)記及其兩側(cè)的多態(tài)標(biāo)記，對(duì)F2群體中20株突變型單株進(jìn)行分析，將目的基因初步定位在RM24134和RM24303標(biāo)記之間(見圖3a).為了精細(xì)定位目的基因，在RM24134和RM24303標(biāo)記之間篩選了7個(gè)SSR多態(tài)標(biāo)記，并設(shè)計(jì)了5個(gè)Indel多態(tài)標(biāo)記，對(duì)F2群體中卷葉矮化突變型單株進(jìn)行分析，最終將rld基因精細(xì)定位在Indel2和Indel5標(biāo)記之間，物理距離約為32.3 kb(見圖3b).

a:rld的初定位；b：rld的精細(xì)定位；c：候選基因及突變位置;

2.4 候選基因的預(yù)測(cè)與測(cè)序分析

根據(jù)Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/Oryza_sativa/location/)提供的基因注釋信息，在rld基因的32.3 kb定位區(qū)間內(nèi)含有3個(gè)候選基因，分別是LOC_Os09g23180，LOC_Os09g23190，LOC_Os09g23200.其中，LOC_Os09g23200基因?yàn)橐芽寺〉木砣~基因RL9[20].通過(guò)設(shè)計(jì)引物和PCR擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)對(duì)rld突變體及其野生型對(duì)照鎮(zhèn)恢084的LOC_Os09g23200基因進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)在該基因第一個(gè)外顯子處，rld突變體比鎮(zhèn)恢084少了3個(gè)堿基(見圖3c)，并導(dǎo)致第181位的精氨酸丟失.

劃紅線區(qū)域代表GARP-DNA結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域；-表示缺失的氨基酸；.表示終止密碼子

2.5 候選基因的蛋白序列分析

根據(jù)氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)第181位的精氨酸位于該基因編碼的GARP-DNA結(jié)合功能保守結(jié)構(gòu)域上(見圖4).通過(guò)swiss-model網(wǎng)站(https://www.swiss-model.expasy.org/)提供的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)模型和功能預(yù)測(cè)信息，將野生型編碼的RL9蛋白和突變體rld編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)模型建立(見圖5a～5b)，顯示這一精氨酸的丟失，引起了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的變化.經(jīng)過(guò)不同物種間的同源氨基酸序列比對(duì)顯示，RL9與KAN家族成員有很高的同源性，結(jié)構(gòu)組織分析顯示,KAN蛋白和RL9蛋白都具有高度保守的GARP結(jié)構(gòu)域，在不同物種間，RL9基因編碼的第181位精氨酸同樣顯示高度保守(見圖6).

3 討 論

卷葉是一種重要的農(nóng)藝性狀，與光合作用和作物產(chǎn)量直接相關(guān).直立的半卷水稻葉片導(dǎo)致增強(qiáng)的光捕獲能力和增加的葉綠素含量，因此，提高了光合效率和產(chǎn)量，葉片適度卷曲同樣可以減少蒸騰作用，提高植株在干旱條件下的忍耐性.對(duì)玉米、甘蔗和谷物高粱的研究表明，葉片維管束和葉肉細(xì)胞的排列與光合效率密切相關(guān).本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的卷葉矮化突變體rld所帶的卷葉基因在生產(chǎn)上具有一定的應(yīng)用價(jià)值.

a：RL9基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)模型；b:rld編碼蛋白結(jié)構(gòu)模型

圖5RL9及rld突變基因編碼蛋白的3D結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)

劃紅線區(qū)域代表GARP-DNA結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域；箭頭處表示rld的突變位點(diǎn)

本文鑒定的卷葉矮化突變體rld，屬于內(nèi)卷，從五葉期開始始終表現(xiàn)高度卷曲，并且伴隨著葉色加深，結(jié)實(shí)率下降等表型，通過(guò)石蠟切片觀察到其維管束之間的下表皮葉肉細(xì)胞面積明顯增大泡狀化從而導(dǎo)致葉片發(fā)生內(nèi)卷.對(duì)rld突變體進(jìn)行了基因精細(xì)定位和候選基因測(cè)序，表明該突變表型是由于RL9基因的第一個(gè)外顯子缺失了3個(gè)堿基，這3個(gè)堿基編碼該基因上的第181位的精氨酸.RL9基因是水稻的轉(zhuǎn)錄因子，編碼一個(gè)SHAQKYF類MYB轉(zhuǎn)錄因子，屬于KANADI家族，該轉(zhuǎn)錄因子包含一個(gè)GARP結(jié)構(gòu)域，其是高度保守螺旋-環(huán)-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，研究表明，GARP結(jié)構(gòu)域?qū)τ谡{(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄具有關(guān)鍵性作用[21]，KANADI家族中該GARP結(jié)構(gòu)域的共有標(biāo)識(shí)高于85%.RL9通過(guò)調(diào)控水稻葉片遠(yuǎn)軸面厚壁組織細(xì)胞的程序化死亡來(lái)調(diào)控水稻葉片的形狀，該基因的突變導(dǎo)致遠(yuǎn)軸面葉肉細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡不能正常進(jìn)行而抑制葉片內(nèi)卷的形成[14].在擬南芥中，KAN家族成員中功能突變的組合喪失導(dǎo)致遠(yuǎn)軸同一性的逐漸喪失，kan1或者kan2單獨(dú)突變具有非常有限的或沒有形態(tài)學(xué)的改變，kan1kan2雙突變體明顯出現(xiàn)了葉片形態(tài)的改變，kan1kan2kan3三突變體更進(jìn)一步增加了葉片的卷曲度且顯示更完全的軸向化[21].本研究中，發(fā)現(xiàn)rld突變體不僅影響葉片表型，而且導(dǎo)致畸形小穗，葉片顯示完全的內(nèi)卷，而在擬南芥中，kan1kan2kan3三突變體才顯示完全內(nèi)卷，表明KAN基因可能在水稻中發(fā)揮更大的作用.

通過(guò)氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，rld突變體由于缺失了一個(gè)精氨酸導(dǎo)致葉片出現(xiàn)高度內(nèi)卷，并且該氨基酸位于RL9蛋白的GARP-DNA結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域中，進(jìn)一步的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸的缺失導(dǎo)致RL9蛋白中GARP結(jié)構(gòu)域蛋白空間結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生改變，也導(dǎo)致GARP保守結(jié)構(gòu)域功能改變，從而影響水稻葉片形態(tài)正常發(fā)育.通過(guò)不同物種間同源氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，RL9基因編碼的第181位的精氨酸在不同物種間一致高度保守，表明該氨基酸在RL9蛋白的正常功能行使過(guò)程中是必要的，對(duì)維持水稻葉片表型具有至關(guān)重要的作用.