張曜 / 必維申美商品檢測（上海）有限公司

0 引言

留蘭香（Mentha spicata L.）是重要的藥用植物，屬唇性科薄荷屬植物，具有強烈的芳香氣味，異名綠薄荷。留蘭香的化學組成主要包括香芹酮、檸檬油精、二氫黃蒿萜酮、樟腦萜、乙酸二氫香芹酯和β-石竹烯。這類揮發(fā)性油由于其獨特的香味和風味被廣泛應用于食品、藥品及化妝品。

1 留蘭香油的功效

1.1 天然抗氧化劑

抗氧化劑是一種能延長油品氧化反應的誘導劑，減緩油品氧化速度，延長油品使用壽命的抑制劑。它是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對人體損害的一類物質?，F(xiàn)在，即使有許多可以抑制氧自由基反應發(fā)生的人工合成的抗氧化性物質，由于安全性和潛在的毒性作用等方面的欠缺，合成抗氧化劑的使用越來越多地受到限制。因而，近年來從天然植物中探索或尋找安全性更高的天然抗氧化物質，引起了許多學者的關注[1]。

1.2 天然抗菌劑

抗菌劑，是指一類用來防治各類病源微生物引起植物病害的藥劑，對病原微生物有殺死作用或抑制生長作用。常見的抗菌劑都是一些化工產品，如果直接運用于人們的日常生活將對身體產生一定的危害。留蘭香油作為天然的植物提取物抗菌劑，將受到消費者的日益青睞。

1）微生物的培養(yǎng)溫度

不同菌種所適合的培養(yǎng)溫度都不一樣，有些溫度適合細菌、真菌生長，有些則抑制其生長，更可能會導致菌的死亡。細菌一般適宜溫度是37 ℃，霉菌與酵母的一般培養(yǎng)溫度則為27 ℃左右。

2）微生物的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。測最小抑菌濃度（MIC），由于是在96 孔板中測試，故所需培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基。而在測最小殺菌濃度（MBC）時，由于使用的是涂布平板法，故需要的是固體培養(yǎng)基，但所有的培養(yǎng)基也必須適合所培養(yǎng)的微生物，所以最終選用了適合菌種生長的培養(yǎng)基：大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和適合真菌用培養(yǎng)基：馬鈴薯液體培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 平板連續(xù)稀釋法與微量稀釋法

目前大多數(shù)的藥物敏感試驗使用的是微量稀釋法和紙片法。兩種方法各自存在優(yōu)缺點，紙片法價格便宜、操作簡便、抗生素選擇靈活，但是紙片法只是定性試驗，且只能用于測試快速生長的細菌；而微量稀釋法雖價格較昂貴，但操作簡便，所以選用微量稀釋法來測定最小抑菌濃度。

涂布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用于計算活菌數(shù)，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用于檢測化學因素對微生物的抑殺效應，所以選用平板涂布法來測定最小殺菌濃度。

2 材料和方法

2.1 材料

留蘭香油（薄荷油），上海蘋果香精香料有限公司；乙醇，中國醫(yī)藥（集團）公司；二甲基亞砜（DMSO），中國醫(yī)藥（集團）公司；吐溫80，中國醫(yī)藥（集團）公司；胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉湯(培養(yǎng)基)TSB，中國醫(yī)藥（集團）公司；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA），中國醫(yī)藥（集團）公司；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，中國醫(yī)藥（集團）公司；DPPH，日本東京化成工業(yè)株式會社；鐵氰化鉀，中國醫(yī)藥（集團）公司；MTT（氯丁膠新型交聯(lián)劑），Sigma-Aldrich 公司（圣路易斯，密蘇里州，美國） ；INT（碘硝基四唑紫溶液），Sigma-Aldrich 公司（圣路易斯，密蘇里州，美國）；胎牛血清（FBS），Invitrogen（USA）；高純氦氣，上海彭浦液化空氣有限公司。

2.2 儀器和設備

GC-MS，5973N，安捷倫科技，美國 ；氣相色譜柱，HP-5，安捷倫科技，美國；

LRH-250 全自動新型生化培養(yǎng)箱，上海精密科學儀器有限公司；SW-CJ-2D/2G 垂直流超凈工作臺，上海精密科學儀器有限公司；TS-200B 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海精密科學儀器有限公司；LDZM-80KCS-ii立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海天美生化儀器設備工程有限公司；752N 紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；FA2104 電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；SB4200DT 超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-S11-2-S 型電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CT14RD 臺式高速冷凍離心機，上海天美生化儀器設備工程有限公司。

2.3 方法

2.3.1 化學組成的測定

留蘭香油中薄荷醇的平均含量是Ruimin Lin 等用GC-MS 的方法測定而得。參考這個方法，用GCMS（氣相色譜-質譜聯(lián)用儀）來分析綠留蘭香油的化學組成，其中氣相色譜柱是采用HP-5 型號的毛細管色譜柱。柱溫箱的起始溫度控制在60 ℃，保持3 min，升溫梯度以 3 K/min 升至 240 ℃，采用恒流模式，柱流量是 1 mL/ min，進樣量是 0.2 μL，分流比是20 ∶1。質譜的離子源采用電子電離源，電子能量是70 eV，四級桿的溫度是150 ℃，離子源溫度230 ℃，電子倍增器的電壓不高于2 200 V，質譜連接處的溫度是250 ℃，溶積延遲3 min，質量數(shù)采集區(qū)間為：40～550。

2.3.2 抗氧化活性

2.3.2.1 DPPH 法

DPPH（2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基）檢測方法通常要涉及氫原子轉移反應，但是，考慮到動力學數(shù)據(jù)，一個電子的轉移機制也已經建立了這個方法。綠留蘭香油上的自由基的活性清除是根據(jù)分光光度法來測定的，它是通過計算減少DPPH 的乙醇溶液而得。

按照Williams 等人的方法，準確稱取DPPH 試劑 0.039 4 g，用無水乙醇溶解定容至 100 mL 容量瓶中，得濃度為1 mmol/L 的DPPH 儲備液，搖勻置于冰箱中冷藏備用。臨用前用無水乙醇稀釋至濃度為0.2 mmol/L 即可。分別取 1.5 mL 各濃度的留蘭香油乙醇液置于不同的4 mL 比色管中，再加入1.5 mL，0.2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，待反應結束，同時需要在合適的溫度下放在暗處60 min。然后分別測定各混合液在518 nm 處吸光值。每一個樣品平行測三次，取平均值，測定DPPH 自由基清除率。

DPPH 溶液中抑制自由基的計算方法如下：

式中：Ablank—— 空白反應的吸光度；

Asample—— 測試樣品的吸光度

用IC50表達抗氧化活性。IC50定義為抗氧化劑需要降低到最初DPPH 濃度的50%。實驗結果是三個實驗的平均值。

2.3.2.2 還原力的檢測

綠留蘭香油的還原力是用PRUSSIAN BLUE（普魯士藍）方法檢測的。取1 mL 不同濃度待測樣品于試管中，依次加入 2.5 mL 磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L PBS，pH 6.6）和 2.5 mL，1%六氰合鐵酸鉀溶液 [K3Fe（CN）6]，于50 ℃水浴保溫20 min 后，快速冷卻，再加入 2.5 mL，10% 三氯乙酸 (TCA)，以 3 000 r/min 離心 10 min，取上清液 5.0 mL，依次加入 5.0 mL 蒸餾水，1.0 mL，0.1%的三氯化鐵（FeCl3）溶液，充分混勻，靜置10 min。反應混合物在700 nm 處測定其吸光值，以蒸餾水代替樣品做空白對照，每一樣品濃度平行測三次，取平均值。

2.3.3 抗菌活性的測定

2.3.3.1 菌種的制備

所用菌株在實驗的前一天晚上，在37 ℃的條件下培養(yǎng)。選出典型的菌落接種到TSB 液體培養(yǎng)基，并在37 ℃條件下培養(yǎng)18 h。由于桔青霉菌和黑曲霉素是真菌，所以其培養(yǎng)溫度是27 ℃。之后用平板細菌計數(shù)方法測定它們生長的混濁度，剩下的混懸液稀釋至細菌群落總數(shù)在 1×105～ 1×106CFU/mL。如果是真菌，完整的細菌被孢子取代，故需挑起孢子來制成孢子混懸液。孢子混懸液的含菌量也稀釋至1×105～ 1×106CFU/mL，用于 CBC 平板細菌計數(shù)方法[6]。

2.3.3.2 測定最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）

在96 孔聚苯乙烯板中，加入100 μL 不同濃度的留蘭香油，使用5%吐溫80 作為溶劑，每孔依次加入 100 μL 培養(yǎng)基和 50 μL 菌液，測試油的最終濃度分別為（400，200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.562 5）μL /mL。96 孔板，用膠帶封好，以減少油揮發(fā)。并準備了陰性對照（含5%吐溫80 的油和培養(yǎng)基）和陽性對照（只含5%吐溫80 的微生物培養(yǎng)基）。細菌懸浮液的微孔板在37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌混懸液須在27 ℃培養(yǎng)48 h。最后，在每個小孔中加入 40 μL 的 INT 溶液（溶解 INT，H2O ∶ C2H5OH 按1 ∶ 1 制成 50 mg/mL），測定最小抑菌濃度（MIC）。因為MIC 為樣品細菌未能增長的最低濃度，所以在培養(yǎng)基中沒有被檢測到有明顯的變化即可[7]。

為了評估最小殺菌濃度（MBC），在沒有加入INT 的條件下重復上述實驗。100 μL 沒有被檢測到有明顯變化的被檢液涂布到瓊脂培養(yǎng)基平板上，觀察其微生物的生長情況。細菌板在37 ℃培養(yǎng)48 h，而有真菌的須于27 ℃培養(yǎng)72 h。MBC 是細菌未能成長在這個平板上的最低濃度。所有的實驗須平行測試三次。

2.3.4 細胞毒性的測定

綠留蘭香油的海拉細胞有細胞毒性，可用MTT方法[8-10]檢測。海拉細胞的接種方法是每5 000 個細胞接種到含有200 μL 生長培養(yǎng)基的96 孔板中，培養(yǎng)24 h，等到有80%的覆蓋密度，才能用于檢測。然后把原培養(yǎng)基用新鮮的無血漿培養(yǎng)基來代替，再放入連續(xù)稀釋的不同濃度的綠留蘭香油。細胞在孵育72 h 后需要把培養(yǎng)基換成新的生長培養(yǎng)基再加入20 μL 的 MTT。再需要培養(yǎng) 4 h，隨后加入 150 μL 的DMSO，之后就可以在570 nm 處用酶標儀測定吸光度。細胞的活力度就是通過這些數(shù)據(jù)計算而得。

細胞的活力度通過下列公式計算而得：

式中：Atest—— 綠留蘭香油中處理過的細胞的吸光度；

Acontrol—— 綠留蘭香油沒有處理過的細胞的吸光度

3 結果與結論

3.1 化學組成的測定

揮發(fā)性油已廣泛應用于食品、化妝品和制藥行業(yè)，因此，現(xiàn)在各種芳香植物揮發(fā)性油的生物活性研究已經是有吸引力的研究領域之一。這項研究評估了在中國研究留蘭香油的化學成分和生物活性。通過面積歸一化法，對留蘭香油的主要揮發(fā)性物質進行了測定，留蘭香油的GC-MS 分析結果列于表1。在研究留蘭香油中被鑒定出的21 種化合物占總油的97.10%。揮發(fā)性油中主要成分是香芹酮（65.33%），檸檬油精（18.19%），二氫黃蒿萜酮（2.97%），樟腦萜（2.34%），乙酸二氫香芹酯（1.54%）和β-石竹烯（1.12%）。關于留蘭香油成分的已發(fā)表的報道相對較少。

表1 留蘭香油的化學成分

3.2 抗氧化活性的測定

3.2.1 DPPH 測試

留蘭香油其潛在的抗氧化活性通過2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）測定方法來篩選。DPPH是一個穩(wěn)定的自由基，可以很容易地發(fā)現(xiàn)一種抗氧化劑存在的減少。這表明在518 nm 有最大的紫外線和可見光（UV-VIS）吸光度。首先，得出了一個結論，留蘭香油自由基的清除反應是在反應開始50 min 后穩(wěn)定的（圖1）。之后，使用不同濃度的留蘭香油，以測試其DPPH 自由基清除能力并發(fā)現(xiàn)當濃度高于189.7 mg/mL 時，其清除自由基能力停止大幅增加，并保持在一個穩(wěn)定的水平。所以，選擇留蘭香油濃度從27.1～189.7 mg/mL，以確定其準確的IC50。結果表明，在控制劑量和時間條件下，留蘭香油能有效和快速地抑制DPPH 自由基的形成，表明有效的抗氧化劑活性（圖2）。在這項研究中，留蘭香油有去清除DPPH 自由基的能力是在濃度為50%抑制濃度（IC50）的基礎上確定的。留蘭香油的IC50值作為清除能力的評價指標，最終確定為72.07±0.34 mg/mL。

圖1 加入留蘭香油后抑制DPPH 自由基的變化，數(shù)據(jù)表示為平均值（N = 3）

圖2 DPPH 自由基清除率和留蘭香油的濃度之間的線性相關，數(shù)據(jù)表示為平均值（N = 3）

3.2.2 還原力的測定

通過在還原力的檢測中，可以發(fā)現(xiàn)隨著測試樣品活性下降的增加使反應混合液的吸光度也增加（圖3）?？寡趸衔镆驗樗鼈兊倪€原能力導致鐵（Fe3+）還原成亞鐵（Fe2+）的形態(tài)。普魯士藍有色絡合物的形成是由于加入的三氯化鐵還原成亞鐵（Fe2+）的形態(tài)。因此，通過測量在700 nm 處形成普魯士藍可以決定是否具有還原性。在這個實驗中，試驗溶液由黃色改為綠色或藍色取決于抗氧化樣品的還原力。吸光度較高表明較高的還原能力。留蘭香油的濃度從27.1mg/mL 增加至189.7 mg/mL 顯示較大的劑量反應的效果。上述結果表明，作為一種有效的天然抗氧化劑，留蘭香油值得更多的研究。

圖3 吸光度和留蘭香油的濃度之間的線性相關，數(shù)據(jù)表示為平均值（N = 3）

3.3 抗菌活性的測定

3.3.1 留蘭香油的抑菌效果

由表2 可以看出，留蘭香油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母、桔青霉素、黑曲霉素都具有一定的抑制作用，但抑菌作用的大小不同，其順序為：釀酒酵母＞大腸桿菌＞桔青霉素＞黑曲霉素＞金黃色葡萄球菌。

3.3.2 留蘭香油的最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）

通過留蘭香油抑菌和殺菌濃度的測定，獲得抗菌性能的精確數(shù)據(jù)。表2 顯示了他們對5 種微生物測試的最低抑菌濃度（MIC；μL/mL）和最低殺菌濃度（MBC；μL/mL）。表2 顯示，留蘭香油對所有被測試微生物有抑菌和殺菌效果。

它對于抗大腸桿菌、啤酒酵母和桔青霉素是非常有效的。啤酒酵母對留蘭香油較為敏感（MIC 0.781 25 μL/mL）。MBC 的評價也發(fā)現(xiàn)了類似的結果。Aggarwal 和其他人（2002 年）對留蘭香（主要成分是檸檬27.3%和56.6%香芹酮）從隔離油成分的抗菌活性進行了評估。香芹酮被測試出抗廣泛的人類致病真菌和細菌。因此，留蘭香油的抗菌活性高，可能是由于香芹酮含量高。但是Aggarwal 和其他人（2002）沒有評價香芹酮對啤酒酵母的抗性。

表2 留蘭香油的最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）/μL·mL-1

4 結語

植物次生代謝產物，一般顯示了顯著的生物活性，如抗氧化、抗菌。而留蘭香油的應用領域無疑可以擴大，如它顯示的生物活性。因此，用GC-MS和常見的實驗方法研究綠留蘭香油的化學成分，然后評估其生物活性，包括抗氧化、抗菌。結果可提供給食品、化妝品和制藥行業(yè)使用的綠留蘭香油其潛在的抗氧化、抗菌性能。許多植物精油對病菌具有抑制作用，且有許多都已經被開發(fā)利用作為天然的防腐劑，但不少都是粗制品，其中的有效成分含量不穩(wěn)定，有時會隨著環(huán)境及季節(jié)的變化而改變，所以該研究也為探索或尋找安全性更高的天然防腐劑、天然抗氧化物質提供了重要的依據(jù)。