李永榮， 李 紅

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科， 蘭州 730020; 2. 深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院， 深圳 518001)

腦卒中是世界范圍內(nèi)人們常見的死亡原因。腦卒中后缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R) 損傷與局部炎癥、活性氧產(chǎn)生和循環(huán)免疫細胞浸潤有關(guān)[1]。維生素D活性形式，1,25-二羥維生素D3(1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25-VitD3)通過多種細胞和分子機制抑制炎癥進展和活性氧產(chǎn)生，并增強抗氧化劑表達[2,3]。觀察性研究已經(jīng)證實，血清維生素D水平較低腦卒后患者梗死體積較大，功能恢復(fù)較差[4]。上述結(jié)果提示維生素D可能在腦缺血中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。最近有研究報道，由于缺乏維生素D飲食導(dǎo)致基線維生素D低水平，對腦大血管閉塞24 h小鼠功能恢復(fù)無影響[5]。然而基線高水平維生素D對小鼠腦I/R損傷影響未見相關(guān)報道。此外，維生素D不僅能促進小腸對鈣吸收，也可能調(diào)節(jié)大量基因的表達，特別是參與炎癥的相關(guān)基因[6]。本研究在小鼠大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型制備前5 d 連續(xù)補充1,25-VitD3，觀察1,25-VitD3對小鼠I/R后腦損傷的影響，并對其機制進行探討，從而為小鼠I/R后腦損傷的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性C57BL/6 (21-30 g)，購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物中心。室溫下自由飲食和飲水。將C57BL6小鼠隨機分成：Sham組、Vehicle組和1,25-VitD3組，每組均為10只小鼠。Sham 組小鼠只進行MCAO相關(guān)手術(shù)步驟，但不插入線栓。1,25-VitD3組小鼠在MCAO手術(shù)前5 d連續(xù)腹腔注射1,25-VitD3溶液(100 ng/(kg·d))，該溶液中無菌水、丙醇和乙醇比例為5∶4∶1[7]。Vehicle組小鼠MCAO手術(shù)前5 d 連續(xù)腹腔注射等量Vehicle(無菌水、丙醇和乙醇混合液)。

1.2 實驗儀器和試劑

光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；冰凍切片機(德國Leica公司)；1,25-VitD3(美國Sigma公司)；TTC染料(美國Sigma公司)；抗髓過氧化物酶多克隆抗體(美國Sigma公司)；PCR引物由上海內(nèi)含子生物科技有限公司構(gòu)建。

1.3 MCAO模型誘導(dǎo)腦I/R

腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.06 g/kg)麻醉小鼠，剪毛后進行頸部手術(shù)。在顯微鏡下分離頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，對頸總動脈近心端和頸外動脈遠心端結(jié)扎，用針在頸外動脈遠端動脈壁上扎一個小口，將線栓從頸外動脈小孔插入頸總動脈，通過頸內(nèi)動脈到達大腦中動脈，固定線栓，MCAO后1 h 拔出線栓，再灌注24 h 。模型成功的標志是小鼠麻醉清醒后出現(xiàn)手術(shù)側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，小鼠可存活1周。I /R 手術(shù)成功率約為70%。Sham 組小鼠只進行相關(guān)手術(shù)步驟，但不插入線栓。小鼠再灌注24 h，進行神經(jīng)行為學(xué)評分后腹腔注射水合氯醛麻醉，取各組小鼠腦缺血半影區(qū)，進行TTC染色、RT-PCR及免疫組化檢測。

1.4 神經(jīng)功能評分

小鼠再灌注24 h，進行神經(jīng)行為學(xué)評分。0分為運動功能正常；1分為尾部抬起時軀干和對側(cè)前肢屈曲；2分為將小鼠置于光滑平面上，尾部抬起時偏向?qū)?cè)，安靜時姿勢正常；3分為仰臥時偏向?qū)?cè)；4分為無自發(fā)活動；5分為死亡[8]。

1.5 I/R后腦梗死體積的檢測

小鼠再灌注24 h，取各組小鼠腦組織，大腦行冠狀切片，厚度為2 mm。然后將腦片放入1% TTC磷酸鹽緩沖液中，在37℃水浴中避光孵育10 min。腦梗死區(qū)域不染色，而正常腦組織染為深紅色。依據(jù)相關(guān)研究[9]方法計算I/R后腦梗死體積。

1.6 T細胞表型與促炎性介質(zhì)表達檢測

取各組小鼠腦組織缺血半影區(qū)，按RNA提取試劑盒步驟提取腦組織中RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，隨后進行PCR 擴增反應(yīng)。Stat4Rorc、和Gp91phox 其中Stat4上游引物序列為5-CATTTGGTACAAC GTGTC AA C CA-3′，下游引物序列為5′-TGTGGCAGGTGGAGGATTATT A′；Stat6上游引物序5′-ACGGCTCTATG TTGACTTTC -3′，下游引物序列5′-AGATCCTG TTTCCCT TCC-3′；Rorc上游引物序 5′-ACAGCTCCATGCCACCGTAT -3′，下游引物序列5′-TCAAAGCAGGAG C AATGGAAGT-3′；Foxp3上游引物序 5′-GCTGGTCGGG AGAAGAGGAAAA -3′，下游引物序列5′-CAGTATCCCACGGAAA TAACC T-3′；IL-6上游引物序 5′-TGTCTTCCTCACCGATTCCT -3′，下游引物序列5′-ACCA CCCGAGCTC TGT CTTACTC-3′；IL-1β上游引物序 5′-ATGGCAGAAGTACCTAAGCTC-3′，下游引物序列5′-TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAACTCACGT-3′；內(nèi)參均為GAPDH。最后取PCR 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠分析軟件對條帶進行分析， 后將目的條帶與內(nèi)參照積分吸光度比值來評估和mRNA在組織中相對表達量。

1.7 免疫細胞遷移狀況檢測

提取各組小鼠腦組織缺血半影區(qū)，用10%福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片。切片后脫蠟、抗原修復(fù)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性及封閉后，滴加兔抗鼠抗髓過氧化物酶多克隆抗體(1∶200)4℃冰箱過夜。PBS 水洗后滴加山羊抗兔 IgG 二抗(1∶1 000)，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染胞核，脫水，透明，封片。每組小鼠缺血半球隨機選取6個高倍視野(×400)，計數(shù)陽性細胞數(shù)量，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 1,25-VitD3對腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損影響

為了明確基線維生素D升高對小鼠對梗死發(fā)展影響，在I/R前5 d連續(xù)補充1,25-VitD3。再灌24 h后，1,25-VitD3組小鼠梗死體積顯著低于Vehicle組(P<0.05，圖1，表1)。Vehicle組小鼠神經(jīng)功能學(xué)評分為3.0±0.5；1,25-VitD3組小鼠為3.1± 0.6，兩組小鼠評分無統(tǒng)計學(xué)差異(表1)，提示兩組小鼠再灌24 h神經(jīng)功能缺損相似。

Fig.1Typical TTC staining in three groups of mice

GroupCerebral infarction volume(mm3)Neurobehavioral scoreSham 0 0Vehicle35.0±7.3??3.0±0.5??1,25-VitD319.2±3.5??#3.1±0.6??

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsvehicle group

2.2 1,25-VitD3對小鼠腦組織T細胞表達影響

以往研究報道，Th1和γδT細胞促進腦卒中后腦損傷，而Th2和T調(diào)節(jié)細胞通過抑制過度炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護作用[10]。RT-PCR結(jié)果顯示，I/R或1,25-VitD3對Th1轉(zhuǎn)錄因子Stat4表達和Th2轉(zhuǎn)錄因子Stat6表達均無明顯影響。然而，I/R導(dǎo)致Th17/γδ T細胞轉(zhuǎn)錄因子Rorc表達增高，而1,25-VitD3降低Rorc表達。此外，I/R可使T調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達升高，而1,25-VitD3進一步使Foxp3表達升高(表2)。

GroupStat4mRNAStat6mRNARorcmRNAFoxp3mRNASham1.0±0.11.0±0.11.0±0.11.0±0.1Vehicle0.7±0.11.2±0.21.6±0.3??1.7±0.2??1,25-VitD30.8±0.10.9±0.21.2±0.2##2.3±0.2##

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsvehicle group

2.3 1,25-VitD3對小鼠腦組織促炎性介質(zhì)表達影響

由于1,25-VitD3有免疫調(diào)節(jié)作用，因而本研究檢測I/R后腦組織中炎癥介質(zhì)mRNA表達。結(jié)果顯示，1,25-VitD3組小鼠IL-1β、IL-6和Gp91phoxmRNA表達均顯著低于Vehicle組(P<0.05，表3)。

GroupIL-1β mRNAIL-6 mRNAGp91phox mRNASham1.0±0.10.0±0.00.9±0.1Vehicle24.5±6.8??90.0±20.5??6.0±1.2??1,25-VitD35.6±1.4##30.0±5.8##2.6±0.4##

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsvehicle group

2.4 1,25-VitD3對小鼠腦組織浸潤中性粒細胞影響

最后檢測了維生素D對腦損傷部位免疫細胞遷移影響。免疫組化結(jié)果顯示，1,25-VitD3小鼠腦損傷部位中性粒細胞數(shù)量明顯低于Vehicle組(P<0.05，圖2)。

Fig.2Quantification of neutrophil in brain tissue after I/R in mice

*P<0.05

3 討論

炎癥是缺血性腦卒中后繼發(fā)性腦損傷的主要原因，因此是I/R損傷潛在治療靶點[1]。除了在鈣代謝中的作用，維生素D也具有免疫調(diào)節(jié)特性，可以改變各種疾病中對損傷的免疫應(yīng)答[11]。如果維生素D在腦卒中后腦損傷中發(fā)揮作用，其可能代表新的治療方向。本研究結(jié)果表明，外源1,25-VitD3在I/R小鼠中的神經(jīng)保護作用可能與I/R小鼠大腦促炎癥介質(zhì)減少有關(guān)。此外，結(jié)果還表明，補充1,25-VitD3可改變T細胞表型，減少缺血腦組織中中性粒細胞數(shù)量，均有助于外源1,25-VitD3發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

研究結(jié)果顯示，再灌24 h后，1,25-VitD3組小鼠梗死體積顯著低于Vehicle組。然而，在這個時間點，兩組IR小鼠神經(jīng)功能評分無統(tǒng)計學(xué)差異，可能是由于觀察神經(jīng)功能評分時間點相對較早。但是腦梗死體積在再灌24 h時已充分形成[12]。因此，評估維生素D通過抑制炎癥發(fā)揮神經(jīng)保護作用來減少腦梗死體積，本研究選擇再灌24 h。我們的研究結(jié)果類似于以往報道結(jié)果，1,25-VitD3預(yù)處理可降低I/R小鼠腦梗死體積[13]，但是該研究未對神經(jīng)功能進行評估。下一步本研究需在再灌48及72 h在進行神經(jīng)功能評分，觀察兩組小鼠的差異。此外，補充1,25-VitD3發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制也不明確。為此，本研究檢測1,25-VitD3可能調(diào)節(jié)I/R中免疫應(yīng)答的證據(jù)。維生素D可調(diào)節(jié)T細胞表型。例如，在小鼠多發(fā)性硬化模型中，維生素D可下調(diào)Th1和Th17細胞發(fā)育所必需的信號通路[2]。此外，維生素D可促進Th2和T調(diào)節(jié)細胞形成，抑制γδT細胞發(fā)展[14]。研究已經(jīng)表明，Th1和γδT細胞可加重腦卒中后腦損傷，抑制上述細胞則發(fā)揮神經(jīng)保護作用；而Th2和T調(diào)節(jié)細胞被認為可抑制腦卒中后腦損傷[15]。因此我們研究了補充1,25-VitD3發(fā)揮神經(jīng)保護是否與調(diào)制T細胞表型有關(guān)。結(jié)果顯示，I/R或1,25-VitD3對Th1和Th2轉(zhuǎn)錄因子表達均無影響。然而，1,25-VitD3降低Th17/γδ T細胞轉(zhuǎn)錄因子Rorc表達,增加T調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達。上述結(jié)果表明，補充1,25-VitD3促進T調(diào)節(jié)細胞形成，抑制Th17/γδT調(diào)節(jié)細胞，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

補充1,25-VitD3可降低促炎性細胞因子IL-1β和IL-6 mRNA表達。有趣的是，這些細胞因子在Th17和γδT細胞功能中起著關(guān)鍵的作用[16]。此外，我們也觀察到Gp91phoxmRNA表達減少，其在缺血性腦卒中后超氧化物產(chǎn)生及介導(dǎo)細胞損傷中發(fā)揮重要作用[17]。外源性1,25-VitD3可減少損傷部位白細胞聚集[18]，因而我們檢測了I/R后損傷部位中性粒細胞的浸潤。我們觀察到一種趨勢，補充1,25-VitD3可減少小鼠中性粒細胞浸潤。下一步觀察其對其他白細胞浸潤的影響。

總之，本研究表明，補充維生素D可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)緩解小鼠I/R后腦損傷。因此，補充維生素D可能作為一種新的治療腦卒中的研究方向。