董媛媛， 王 琳， 褚 旭， 崔 帥， 孔慶霞△

(1. 山東大學(xué) 齊魯醫(yī)學(xué)院， 濟(jì)南 250012， 2. 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 濟(jì)寧 272000， 3. 濰坊醫(yī)學(xué)院， 濰坊 261053)

癲癇(epilepsy)是由于腦部神經(jīng)元異常放電引起的短暫性腦功能障礙的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有發(fā)作性、短暫性、刻板性的臨床特點(diǎn)[1]。癲癇的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，至今尚未完全明確。研究表明，癲癇的發(fā)生不僅與神經(jīng)元信號通路失調(diào)有關(guān),膠質(zhì)細(xì)胞功能失調(diào)也是癲癇發(fā)生的重要原因[2]。

鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SphK1)在人體中廣泛分布，是將鞘氨醇磷酸化為(sphingosine-1-phosphate，S1P)的關(guān)鍵酶，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。5種同源G蛋白偶聯(lián)受體(S1PRs)介導(dǎo)S1P多種生理性作用。SphK1及其上下游信號分子組成的SphK1/S1P信號通路參與了神經(jīng)發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化和遷移，學(xué)習(xí)記憶等正常生理活動[3,4]。研究發(fā)現(xiàn)，SphK1和1-磷酸鞘氨醇受體2(sphingosine-1-phosphate receptor 2,S1PR2)與神經(jīng)元的興奮性調(diào)節(jié)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte, AST)活化增生密切相關(guān)[5]。SphK1在匹羅卡品致癇小鼠0 h、0.5 h明顯下降，4 h有所回升[6]，而在紅藻氨酸點(diǎn)燃小鼠模型發(fā)現(xiàn)SphK1在致癇后48 h明顯升高[7]，但尚不清楚SphK1和S1PR2從急性期到慢性期的動態(tài)表達(dá)變化及在AST中的表達(dá)情況。本研究運(yùn)用Li-PILO建立癲癇大鼠模型分析SphK1、S1PR2在海馬組織中的表達(dá)變化及在AST中的表達(dá)，探討其在癲癇發(fā)病中可能的機(jī)制，為癲癇的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

氯化鋰、阿托品、匹羅卡品(美國Sigma公司)；小鼠單克隆SphK1一抗、小鼠單克隆S1PR2一抗(美國Santa Cruz 公司 )；兔多克隆GFAP一抗、驢抗兔Alexa Fluor?488、羊抗小鼠Alexa Fluor?568二抗(美國Abcam公司)；兔多克隆β-actin一抗、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠和羊抗兔二抗、RIPA裂解液(北京鼎國昌盛有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL發(fā)光液(美國Millipore公司)；Image Quant LAS 500生物分子成像儀(美國GE公司)；LSM800 共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)。

1.2 動物

SPF清潔級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠108只，體重(230±10)g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司(許可證號：SCXK魯20140007)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為Control組(n=48)和PILO組(n=60)，PILO組進(jìn)行造模處理，根據(jù)造模后觀察時間和行為學(xué)改變，隨機(jī)分為3個大組，6個亞組：急性期組(E6 h、E1 d、E3 d)，潛伏期組(E7 d)和慢性期組(E30 d、E56 d)，保證每個亞組中對照大鼠和癲癇大鼠各8只。PILO組經(jīng)腹腔注射氯化鋰127 mg/kg，18～20 h后注射匹羅卡品30 mg/kg，注射匹羅卡品前30 min注射阿托品1 mg/kg，根據(jù)Racine分級，將發(fā)作≥Ⅳ級且持續(xù)時間≥30 min的大鼠判定為造模成功，注射匹羅卡品后30 min發(fā)作

1.4 實(shí)驗(yàn)樣本的采集與處理

癲癇組E6 h、E1 d、E3 d、E7 d、E30 d、E56 d(對照組在相同時間點(diǎn))經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉。每組中4只大鼠麻醉后斷頭取腦，于冰上迅速分離海馬，制備組織勻漿，提取蛋白，用于Western blot以檢測SphK1和S1PR2在海馬組織中的表達(dá)變化；另4只大鼠用4%多聚甲醛固定，取完整大腦組織，經(jīng)30%蔗糖溶液脫水后，于海馬吻合處行冠狀冰凍切片(6 μm)，用于免疫熒光以檢測SphK1和S1PR2在大鼠海馬AST中的表達(dá)情況。

1.5 Western blot檢測SphK1和S1PR2在大鼠海馬中的表達(dá)變化

BCA法測定蛋白濃度，99℃水浴蛋白變性5 min，以30 μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳(層積膠80 V；分離膠110 V)；濕法轉(zhuǎn)膜(80 V恒壓)；5%脫脂牛奶的封閉液中室溫封閉1 h；一抗SphK1(1∶ 1 000)、S1PR2(1∶1 000)、β-actin(1∶10 000)4℃孵育過夜；TBS-T洗3次，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠(1∶10 000)、羊抗兔(1∶10 000)二抗室溫孵育1 h，TBS-T洗3次，TBS洗1次；滴加ECL發(fā)光液顯影，Image J軟件進(jìn)行灰度值測定。

1.6 免疫熒光檢測大鼠海馬GFAP的表達(dá)及SphK1和S1PR2在AST中的定位表達(dá)

冰凍切片于0.1 mol/L PBS中復(fù)溫10 min，含10%山羊血清和0.3% 曲拉通的封閉液室溫封閉2 h；分別滴加一抗：兔GFAP(1∶1000)、鼠SphK1抗體(1∶500)+兔GFAP(1∶1 000)和鼠S1PR2抗體(1∶500)+兔GFAP(1∶1 000)，4℃孵育過夜；0.1 mol/L PBS洗3次，熒光二抗(1∶1 000)室溫避光孵育1 h；0.1 mol/L PBS洗3次，用含DAPI的抗熒光衰減封片劑封片，共聚焦顯微鏡拍照，每只動物隨機(jī)取3張切片，每張切片取3個視野。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測SphK1和S1PR2在大鼠海馬組織中的表達(dá)變化

Western blot曝光條帶如圖1，與Control組比較，SphK1的表達(dá)在急性期(E3 d)、潛伏期(E7 d)和慢性期(E30 d、E56 d)均明顯升高(P<0.05或P<0.01)；S1PR2在急性期(E1 d、E3 d)、潛伏期(E7 d)和慢性期(E30 d、E56 d)的表達(dá)均明顯下降(P<0.05或P<0.01，表1)。

Fig.1Western blot showing the time course of SPHK1 and S1PR2 expression in the rat hippocampus after PILO treatment

A: Control; B: E6 h; C: E1 d; D: E3 d; E: E7 d; F: E30 d; G: E56 d

GroupSphK1ControlPILOS1PR2ControlPILOE6 d1.27±0.210.95±0.371.06±0.061.26±0.19E1 d1.19±0.101.01±0.101.18±0.101.22±0.56E3 d1.28±0.200.54±0.10??1.11±0.081.38±0.09?E7 d1.04±0.260.51±0.07?1.27±0.091.66±0.11??E30 d1.20±0.170.53±0.21?1.17±0.041.52±0.18?E56 d1.11±0.170.54±0.05??1.20±0.091.60±0.22?

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.2 免疫熒光檢測大鼠海馬AST活化增生情況

免疫熒光結(jié)果如圖2，GFAP呈綠色熒光，與對照組相比，PILO組(E7 d)大鼠海馬區(qū)AST細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.05)，GFAP熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.05，表2)。PILO組(E7 d)AST多處于活化狀態(tài)，AST由胞體小、突起少而纖細(xì)變?yōu)榘w肥大、突起多且增粗、伸長，呈放射狀(圖2)。

Fig.2Astrocyte activation and proliferation in rat hippocampus(Immunofluorescence ×200 )

GroupNumber of astrocytesAOD of GFAPControl32.60±6.351.19±0.33PILO (E7d)56.60±12.84?2.21±0.74?

AOD: Average optical density

*P<0.05vscontrol group

2.3 免疫熒光染色檢測SphK1和S1PR2在大鼠海馬AST中定位表達(dá)情況

免疫熒光觀察到SphK1(圖3A和3B)和S1PR2(圖3C和3D)呈紅色熒光，GFAP為綠色熒光，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色熒光；疊加后發(fā)現(xiàn)SphK1在Control組和PILO組(E7d)海馬AST的細(xì)胞核中表達(dá)；S1PR2在Control組海馬AST的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，在PILO組(E7d)海馬AST的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。

3 討論

難治性癲癇患者腦內(nèi)AST異常增生，釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子，并導(dǎo)致α-氨基戊二酸代謝和遞質(zhì)傳遞異常，促進(jìn)癲癇的進(jìn)展[8]。研究發(fā)現(xiàn)，SphK1/S1P信號在調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和存活中起著關(guān)鍵作用[9,10]。有研究報道SphK1和S1PR2在部分AST中表達(dá)，與神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)有關(guān)[5,10]。而SphK1和S1PR2在癲癇中的研究相對較少，具體機(jī)制尚不明確。

匹羅卡品致癇模型是一種SE模型，此模型首先激活膽堿能系統(tǒng)誘發(fā)癲癇發(fā)作，并激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體以維持癲癇發(fā)作[11]。本研究通過匹羅卡品成功誘導(dǎo)大鼠SE，表現(xiàn)為前肢站起伴跌倒的全身強(qiáng)直-痙攣大發(fā)作。根據(jù)文獻(xiàn)報道，匹羅卡品致癇大鼠經(jīng)歷較短的潛伏期，在SE后平均(7.2±3.6)d由視頻EEG記錄到第1次癲癇自發(fā)性發(fā)作，之后進(jìn)入慢性期[12]。在本實(shí)驗(yàn)中大鼠造模后急性期E6 h～E3 d觀察到癲癇發(fā)作，而在E5 d～E7 d無行為學(xué)異常為潛伏期，從E28 d開始觀察到癲癇自發(fā)性反復(fù)發(fā)作，進(jìn)入慢性期。

本研究在匹羅卡品致癇大鼠模型中證實(shí)SphK1在癲癇海馬組織中的表達(dá)顯著增加,提示SphK1在癲癇中具有潛在的研究價值。通過研究其動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)SphK1在致癇后第3日開始升高，推斷SphK1參與了癲癇最初的誘發(fā)性腦損傷，SphK1在潛伏期和慢性期的表達(dá)仍高于對照組，提示SphK1很有可能參與了癲癇的形成過程，與慢性期自發(fā)性癲癇發(fā)作有關(guān)，在此過程中神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的興奮性改變，正常腦轉(zhuǎn)變?yōu)榘d癇腦，導(dǎo)致癲癇自發(fā)性發(fā)作并伴隨其整個生命過程[13]。

研究表明，鹽酸小檗堿通過抑制SphK1/S1P信號減輕AST介導(dǎo)的多發(fā)性硬化小鼠模型的神經(jīng)炎癥[14]。Wu等[15]發(fā)現(xiàn)，SphK1遺傳缺失(SphK1-/-)可能通過減少神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞和AST增生減輕疾病的病程。本研究結(jié)果顯示SphK1在癲癇大鼠(E7d)海馬AST中表達(dá)，說明SphK1表達(dá)增加可能與癲癇后AST的異?；罨錾嚓P(guān)。我們推測癲癇發(fā)生過程中損傷的海馬區(qū)SphK1被激活，局部神經(jīng)元和AST合成分泌S1P增加，作為細(xì)胞內(nèi)第二信使或以自分泌及旁分泌的方式作用于S1PRs，通過多途徑信號傳導(dǎo)促進(jìn)了AST異?；罨錾４送猓琒1P合成增加可作為胞內(nèi)第二信使抑制K+外向電流，增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性[16]。毛[6]發(fā)現(xiàn)SphK1在匹羅卡品致癇小鼠E0 h、E0.5 h時表達(dá)下調(diào)可能激活A(yù)kt/NF-κB信號通路促進(jìn)SE后海馬神經(jīng)元的凋亡，袁等[17]報道了S1P可能通過激活PI3K-Akt抑制心肌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮心機(jī)保護(hù)的作用，表明SphK1/S1P信號與心肌細(xì)胞和神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SphK1的表達(dá)水平增加可能促進(jìn)SE后海馬神經(jīng)元的存活，并通過離子通道機(jī)制改變了神經(jīng)元的興奮性而促進(jìn)癲癇的發(fā)生。

S1PRs偶聯(lián)的G蛋白亞基有重疊和不同，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、炎癥、細(xì)胞骨架重排和粘連等過程。在大鼠CNS發(fā)育的早期階段，S1PR2基因在分化神經(jīng)元的胞體和軸突中表達(dá)[18]。全細(xì)胞膜片鉗檢測到S1PR2缺陷(S1PR2 -/-)皮層錐體神經(jīng)元興奮性異常增高，由此證實(shí)了S1PR2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)參與神經(jīng)元的興奮性調(diào)節(jié)[19,20]。Akahoshi等[5]的研究發(fā)現(xiàn)S1PR2 -/-可能損害某些特定CNS的功能并導(dǎo)致海馬損傷和致死性癲癇發(fā)作，伴隨著海馬膠質(zhì)細(xì)胞的異常增生。本研究發(fā)現(xiàn)S1PR2 在致癇后E3 d開始下降，在潛伏期、慢性期的表達(dá)均低于對照組的表達(dá)水平，并證實(shí)S1PR2在癲癇大鼠(E7 d)海馬AST中表達(dá)，提示S1PR2表達(dá)缺陷或減少引起下游傳導(dǎo)通路信號改變，可能導(dǎo)致AST異常活化增生，由此促進(jìn)癲癇的發(fā)生。

綜上所述，本研究初步表明SphK1和S1PR2可能通過調(diào)控AST活化增生和影響神經(jīng)元興奮性參與癲癇的發(fā)生。進(jìn)一步對SphK1和S1PR2進(jìn)行抑制及過表達(dá)干預(yù)，深入研究相關(guān)信號分子的表達(dá)改變，從而為癲癇的治療提供潛在的新靶點(diǎn)。