姬衛(wèi)秀， 張 纓

(1．北京體育大學， 北京 100084； 2．天津體育學院， 天津 301617)

眾所周知，模擬低氧訓練或高原訓練可以提高運動員骨骼肌的耐力水平。有研究顯示，人和大鼠在低氧耐力訓練后，骨骼肌中氧化物的產(chǎn)生減少，抗氧化酶表達增加，其效果比常氧訓練更佳[1]。這些結果暗示，運動耐力的提高至少部分與低氧引起的骨骼肌抗氧化能力增強有關。然而，不同氧濃度的低氧環(huán)境刺激可能對骨骼肌氧化還原狀態(tài)影響不同。已有研究發(fā)現(xiàn)，不適宜的低氧刺激，可誘發(fā)機體骨骼肌的氧化損傷，引起骨骼肌超微結構的改變，而適宜氧濃度的低氧刺激提高其抗氧化能力，降低脂質過氧化水平[2]。不同氧濃度的低氧環(huán)境下如何影響骨骼肌的抗氧化作用機制，目前并不十分清楚。

轉錄因子NF-E2相關因子(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是細胞氧化應激反應中的關鍵轉錄因子。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Keapl耦聯(lián)，被錨定于胞漿中，使Nrf2處于抑制失活狀態(tài)。缺氧時，細胞線粒體代謝異常， “電子漏”增加，使活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成大量增加，使細胞處于氧化應激狀態(tài)。當受到外界氧化應激刺激后，Keap1蛋白的構象會發(fā)生一些變化，使得與Nrf2的偶聯(lián)作用發(fā)生解離，Nrf2轉位進入細胞核，與核內(nèi)的小分子Maf蛋白形成雜化二聚體，然后與DNA序列上的抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)結合, 啟動下游抗氧化酶基因如超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、醌氧化物還原酶(NADPH: quinine oxidoreductase-1，NQO-1)、血紅素氧化酶(heme oxygenase-1，HO-1)、谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase-1，GPX-1)等的轉錄，成為許多抗氧化基因的開關[3]。

Nrf2-ARE介導的抗氧化信號通路，目前被認為是細胞抗氧化防御系統(tǒng)的核心部分[4]。對低氧敏感的盲鼴鼠的基因檢測發(fā)現(xiàn)，Nrf2與低氧適應密切相關[5]。在不同氧濃度下的C2C12細胞中Nrf2介導的抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮怎樣的作用，目前并未見相關報道。因此，本研究采用小鼠骨骼肌C2C12細胞系，在常氧和不同氧濃度低氧環(huán)境中培養(yǎng)，探討不同氧濃度下C2C12細胞中Nrf2介導的抗氧化系統(tǒng)對H2O2刺激反應的變化，為低氧在生活中的應用和低氧訓練提高運動員成績提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞系(C2C12細胞)，國家實驗細胞共享平臺北京總部； CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(G3580)試劑盒, Promega公司；抗熒光淬滅封片劑，中杉金橋，ZLI-9557； BCA Protein Assay Reagent，美國Thermo Scientific公司；Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus凝膠，美國life technologies公司；NuPAGE MOPS SDS(20×)電泳緩沖液，美國life technologies公司；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，Cat#9767； SYBR Green Realtime PCR Master Mix，Toyobo公司； GENMED的ROS試劑盒，GMS10016.1。

常氧恒溫培養(yǎng)箱，日本 SANYO 公司；熒光共聚焦顯微鏡，德國LeicaSP8；iBlot 2轉膜儀，美國Invitrogen公司；BIO-RAD凝膠顯影儀；熒光定量PCR儀，美國ABI7500。

1.2 C2C12 細胞培養(yǎng)

小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞系(C2C12細胞)購于國家實驗細胞共享平臺北京總部。細胞復蘇后，加入在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(青霉素106U/ml，鏈霉素100 U/ml)，置于37°C、5%CO2的常氧恒溫培養(yǎng)箱。兩天換液一次，待細胞生長至融合度為80%～90%時, 用0.25%胰蛋白酶進行消化1 min后，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打，置于顯微鏡下觀察均為單個細胞后，進行傳代至3代后，進行正式實驗。本實驗在北京體育大學教學實驗中心細胞培養(yǎng)實驗室完成。

1.3 H2O2濃度及作用時間的選擇

取對數(shù)期的C2C12細胞，消化后吹打制備成單細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，接種密度約為2.5×105cells/ml，置于37°C、5%CO2的常氧恒溫培養(yǎng)箱24 h后，棄舊培養(yǎng)基，PBS清洗每孔，將細胞分為7組，每組復孔8個，其中對照組不做任何處理，繼續(xù)用10%的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余6組分別加入含不同濃度H2O2的(0.1 mmol/L、0.25 mmol/L、 0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L)完全培養(yǎng)基，100 μl/孔，置于37°C、5%CO2常氧恒溫培養(yǎng)箱中孵育。經(jīng)1和2 h后分別取一塊96孔細胞培養(yǎng)板測細胞活力。

使用Promega公司CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(G3580)試劑盒測細胞活力。具體操作如下：細胞經(jīng)過一定時間的處理后，將其細胞培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗兩次，加入含MTS的完全培養(yǎng)基，置于37°C、5%CO2常氧恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，用酶標儀在490 nm下測每孔的OD值。

1.4 不同氧濃度條件下C2C12細胞對H2O2刺激的實驗設計

在現(xiàn)有實驗條件下，將細胞分為不同氧濃度組，即21%、12%、8%和5%O2組。將處于對數(shù)期生長的C2C12細胞，按2.5×105cells/ml的密度接種于培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)板上，每組復孔8個，待細胞融合度達到約80%時，轉移入氧濃度分別為21%、12%、8%和5%的37°C、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行繼續(xù)培養(yǎng)。待8組細胞各自培養(yǎng)12 h后，棄掉舊培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入含有0.5 mmol/L的H2O2完全培養(yǎng)基作用1 h后，收集細胞或繼續(xù)進行其他測試。

1.5 測試指標及方法

1.5.1 培養(yǎng)C2C12細胞免疫熒光 取出已爬好細胞的玻璃底培養(yǎng)皿，常溫PBS洗3次，用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，0.5% Triton X-100(PBS配制)室溫通透5 min，在小皿中間加入BSA(2.5%，PBS稀釋)封閉液，室溫封閉30 min后，加入一抗(Nrf2，sc-365949，Santa Cruz)，放入濕盒，4℃過夜。第2日，去除一抗，加入熒光二抗(兔抗鼠bc-0296R-AF488，博奧森)，避光室溫孵育30 min，PBS避光洗3次后，吸干液體，加入含DAPI的抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

為了確?；鶎愚r(nóng)村河道清淤施工的質量，在確定清淤施工所用施工技術的基礎上，需要做好必要的施工準備工作，為后續(xù)的施工奠定良好條件。具體準備工作要點如下，一是做好施工布置。要本著因地制宜、經(jīng)濟合理和可靠安全等原則，立足于基層農(nóng)村河道清淤的實際情況，嚴格依據(jù)施工招標文件等來做好施工布置工作。二是組織設計單位、建設單位及監(jiān)理單位等做好水準點和控制點等的施工測量與放樣工作，確保相關淤泥清除表面標高等控制的準確性。三是要做好河道清淤施工中所用設備的良好運行和維護管理，確保設備運行狀態(tài)良好，為后續(xù)的河道清淤奠定良好的施工基礎。

1.5.2 Nrf2蛋白表達的Western blot檢測 對提取的蛋白進行BCA蛋白濃度測定，根據(jù)濃度計算配樣，上樣量為10 μg。采用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus凝膠和NuPAGE MOPS SDS(20×)電泳緩沖液進行電泳。用iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉移至NC膜。目的條帶標記后用5%的脫脂牛奶或BSA封閉1 h后，進行一抗孵育：Nrf2(sc-722，1∶200)、總蛋白內(nèi)參β-actin(sc-47778，1∶1 000)，于4°C搖床孵育過夜。次日洗脫一抗后進行二抗孵育1 h：Nrf2(羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1∶2 000)。最后洗脫二抗后加發(fā)光液用BIO-RAD凝膠顯影儀器進行顯影，用其配套軟件進行條帶檢測與分析。讀取灰度值，計算結果，公式如下：

1.5.3 培養(yǎng)C2C12細胞相關基因表達的RT-PCR檢測 采用TaKaRa公司的試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，Cat#9767)提取細胞RNA。按照反應體系為65℃，5 min; 37℃，15 min; 98℃，5 min的反應體系進行逆轉錄成cDNA。然后取2 μl cDNA加入熒光染料反應體系(Toyobo公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix)及一定量的引物，采用熒光定量PCR儀，進行實時熒光定量PCR，其中引物分別為Nrf2(QT00095270)、SOD1(QT00165039)、SOD2(QT00161707)、CAT(QT01058106)、NQO-1(QT00094357)、HO-1(QT00159915)、GPX-1(QT01195936)、18S rRNA (QT010036875)反應完成后使用PCR儀自帶的軟件對實時熒光定量CT值進行讀取，用比較 CT 法對目的基因表達結果進行相對定量。具體計算公式如下:

目的基因=2-△△CT

1.5.4 培養(yǎng)C2C12細胞產(chǎn)生ROS測定 采用GENMED的試劑盒(GMS10016.1)產(chǎn)地公司測定細胞產(chǎn)生的ROS，實驗操作嚴格遵循試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 H2O2濃度及作用時間的選擇

采用獨立樣本t檢驗比較與對照組之間細胞活力的差異，得知：H2O2作用于C2C12細胞1 h，濃度為0.5 mmol/L，0.75 mmol/L，1 mmol/L，2 mmol/L中的C2C12細胞活力均出現(xiàn)顯著性降低(P<0.05，表1)；將H2O2作用時間延長到2 h，與對照組相比，H2O2濃度為0.5 mmol/L時，C2C12細胞活力即出現(xiàn)非常顯著降低(P<0.01)，且隨H2O2濃度的升高C2C12細胞活力出現(xiàn)急劇降低。綜合比較，選擇H2O2作用時間相對較短的1 h組中，濃度0.5 mmol/L，作為本實驗的H2O2刺激。

Group1H2HControl0.869±0.1020.997±0.1170.1 mmol/L0.864±0.0960.812±0.148??0.25 mmol/L0.783±0.1670.735±0.126??0.5 mmol/L0.663±0.111??0.679±0.229??0.75 mmol/L0.652±0.050??0.403±0.075??1 mmol/L0.746±0.108?0.358±0.061??2 mmol/L0.649±0.078??0.304±0.033??

1H： cell cutured in H2O2for 1 hour； 2H： Cell cutured in H2O2for 2 hours； 0.1 mmol/L： H2O2concentration was 0.1 mmol/L； 0.25 mmol/L： H2O2concentration was 0.25 mmol/L； 0.5 mmol/L：H2O2concentration was 0.5 mmol/L； 0.75 mmol/L： H2O2concentration was 0.75 mmol/L； 1 mmol/L： H2O2concentration was 1 mmol/L； 2 mmol/L： H2O2concentration was 2 mmol/L

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.2 不同氧濃度下C2C12細胞對H2O2刺激的Nrf2蛋白免疫熒光的影響

由圖1可知，21%O2組C2C12細胞Nrf2蛋白(綠色)主要位于細胞核(藍色)外的胞漿。與21%O2組相比，12%O2組C2C12細胞Nrf2蛋白熒光強度高，8%O2組細胞Nrf2蛋白熒光無變化，5%O2低氧組的細胞Nrf2蛋白熒光弱。說明，氧濃度不同細胞Nrf2蛋白表達量不同(圖1見彩圖頁Ⅱ)。

2.3 不同氧濃度下C2C12細胞對H2O2刺激的Nrf2 mRNA和蛋白表達的影響

GroupNrf2 mRNA/18S rRNANrf2 protein/β-actin21%O21.000±0.2071.005±0.15212%O21.394±0.486?1.321±0.407?8%O21.178±0.4191.031±0.2155%O20.740±0.210?0.729±0.274?

21%O2； Concentration of O2was 21%； 12%O2； Concentration of O2was 12%； 8%O2； Concentration of O2was 8%；5%O2； Concentration of O2was 5%； Nrf2： NF-E2-related factor

*P<0.05vs21% O2group

12%氧濃度低氧可促進Nrf2表達，5%氧濃度低氧則會抑制Nrf2表達。

2.4 不同氧濃度下C2C12細胞對H2O2刺激的抗氧化酶mRNA表達的影響

由表3可知，與21%O2組相比，12%O2組C2C12細胞抗氧化酶SOD1(P<0.05)、SOD2(P<0.01)、CAT(P<0.05)、NQO-1(P<0.05)、HO-1(P<0.05)、GPX-1(P<0.01)的mRNA顯著增加；8%O2組細胞抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT、NQO-1、HO-1 mRNA略有增加但均無顯著性變化，只有GPX-1(P<0.05)mRNA顯著增加；而5%O2組細胞抗氧化酶SOD1(P<0.05)、SOD2(P<0.01)、NQO-1(P<0.01)、GPX-1(P<0.01)的mRNA則顯著降低，CAT和HO-1 mRNA無顯著變化。說明，12%氧濃度低氧可促進Nrf2介導的下游抗氧化酶mRNA表達，5%氧濃度低氧則對抗氧化酶mRNA表達具有抑制作用。

Tab. 3 Changes of the mRNA relative expressions of antioxidant enzyme in cells of each group n=8)

21%O2： Concentration of O2was 21%； 12%O2： Concentration of O2was 12%； 8%O2；Concentration of O2was 8%； 5%O2： Concentration of O2was 5%； SOD1： Superoxide dismutase 1； SOD2： Superoxide dismutase 2； CAT： Catalase； NQO-1： NAD(P)H: quinine oxidoreductase-1； HO-1： Heme oxygenase-1； GPX-1： Glutathione peroxidase-1

*P<0.05,**P<0.01vs21%O2group

2.5 不同氧濃度下C2C12細胞對H2O2刺激的ROS水平的影響

由表4可知，與21%O2組相比，12%O2組C2C12細胞ROS水平非常顯著性降低(P<0.01)，8%O2組細胞ROS水平無顯著性變化，5%O2組的細胞ROS水平則非常顯著升高(P<0.01)。

GroupROS (fluorescence intensity)21%O2103468.9±3635.512%O265987.8±15168.0??8%O2125976.7±26214.25%O2116144.5±5085.0??

21%O2： Concentration of O2was 21%； 12%O2： Concentration of O2was 12%； 8%O2： Concentration of O2was 8%； 5%O2： Concentration of O2was 5%； ROS： Reactive oxygen species

**P<0.01vs21%O2group

3 討論

低氧引起自由基的產(chǎn)生增多，激活抗氧化酶活性，低氧預適應可上調抗氧化酶等基因的表達，從而預防因缺氧而導致的損傷。對人類細胞實驗發(fā)現(xiàn)，絨毛外滋養(yǎng)層細胞在10%氧濃度低氧條件下24 h，Nrf2 mRNA表達顯著升高[6]；癌細胞在極限低氧環(huán)境(氧濃度小于0.05%)出現(xiàn)Nrf2蛋白表達增加，Keap1表達降低[7]。SD大鼠在氧濃度為6%的低氧環(huán)境中暴露1 h和低氧暴露后又復氧均可增加其腦部微血管Nrf2的易位[8]。研究發(fā)現(xiàn)，低氧刺激可使人血液中SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶基因的表達量增加，且世居高原者血液中抗氧化酶SOD水平較世居平原者高[9]。在細胞實驗中也發(fā)現(xiàn)，小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5在化學性低氧后，抗氧化酶SOD和CAT mRNA表達增加[10]。在本研究中，12%氧濃度低氧處理C2C12細胞12 h后，細胞Nrf2 mRNA和蛋白表達水平升高，下游抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT、NQO-1、HO-1和GPX-1的mRNA表達量也均顯著增加，C2C12細胞ROS水平則出現(xiàn)非常顯著降低。表明12%氧濃度低氧可以刺激C2C12細胞Nrf2表達增加。Nrf2的表達增加，可能使Nrf2轉位入核增加，與ARE結合作用增強，進而使下游抗氧化酶的轉錄水平提高，mRNA表達水平上調，抗氧化作用增強，對細胞內(nèi)自由基的清除能力增強，最終使得C2C12細胞ROS水平降低。說明C2C12細胞可能為了對氧濃度為12%的低氧環(huán)境產(chǎn)生適應，發(fā)生了一系列代償性反應，對細胞產(chǎn)生了一種保護作用。

有人發(fā)現(xiàn)，10%氧濃度低氧處理大鼠心肌H2C9細胞4 h，細胞死亡率基本無變化[11]。SD大鼠在模擬海拔高度5 000 m低壓氧艙中持續(xù)暴露4周，心肌中抗氧化酶SOD活力也未發(fā)生顯著性變化[12]。而在本研究中氧濃度為8%的低氧刺激，對C2C12細胞Nrf2 mRNA和蛋白表達變化影響不大，對其下游抗氧酶的表達也基本無影響，只有GPX-1的mRNA表達增強，且細胞ROS水平也未發(fā)生顯著變化。說明在本實驗中的8%O2對C2C12細胞的Nrf2抗氧化系統(tǒng)影響不大，可能由于C2C12細胞對氧濃度為8%的低氧刺激不敏感，或者可能已發(fā)生了耐受作用，產(chǎn)生了適應，故Nrf2抗氧化系統(tǒng)未發(fā)生顯著變化。

陳然發(fā)現(xiàn)，SD大鼠在氧濃度為5%的低氧艙中，間歇低氧作用3周后，主動脈和腎組織胞漿、胞核中Nrf2蛋白的表達均顯著下調[13]。人類絨毛外滋養(yǎng)層細胞在3%氧濃度低氧條件下24 h，Nrf2 mRNA表達顯著降低[6]。HT22細胞在氧濃度2.5%低氧處理24 h后復氧，其細胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達降低[14]。有報道指出，在1%氧濃度低氧下，骨骼肌細胞系橫紋肌肉瘤細胞中抗氧化酶GSH、SOD、CAT、GST、GPx的蛋白表達非常顯著性降低[15]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)轉化細胞RGC-5在5%氧濃度低氧中培養(yǎng)，抗氧化酶GSH含量明顯降低，MDA顯著升高[16]。成人心肌細胞經(jīng)1%氧濃度低氧處理后，ROS水平也顯著升高[17]。本研究中，C2C12細胞在氧濃度為5%的低氧環(huán)境中Nrf2 mRNA和蛋白表達均降低，抗氧化酶SOD1、SOD2、NQO-1和GPX-1的mRNA表達量也出現(xiàn)顯著下降，細胞ROS水平則呈現(xiàn)顯著增加。氧濃度5%的低氧抑制了C2C12細胞Nrf2的表達，而抗氧化酶的表達隨Nrf2表達的變化而發(fā)生變化，氧濃度為5%的低氧環(huán)境可能由于氧濃度太低抑制了Nrf2的表達，進而對下游抗氧化酶的表達也產(chǎn)生了抑制作用，使細胞抗氧化能力降低，自由基清除能力降低，細胞ROS水平升高，說明氧濃度為5%低氧可能引起了細胞氧化損傷，這可能與細胞的代謝失?；蚬δ芪蓙y有關[15]。

生理條件下，機體本身也會產(chǎn)生自由基，但在自由基產(chǎn)生的同時，體內(nèi)也存在著清除自由基的抗氧化酶等防御系統(tǒng)，兩者共同發(fā)揮作用，就會使機體內(nèi)自由基的生成和消除處于一種動態(tài)平衡；但是，當機體處于低氧環(huán)境中時，這種氧化和抗氧化系統(tǒng)間的動態(tài)平衡就有可能被打破。在本研究中，C2C12細胞處于12%氧濃度低氧時，低氧強度適宜，產(chǎn)生新的平衡，機體產(chǎn)生適應，則抗氧化能力提高；而C2C12細胞處于5%氧濃度低氧時，低氧強度過大，會使氧化和抗氧化一直處于失衡狀態(tài)，最終使得機體的抗氧化能力下降。之前有研究也曾發(fā)現(xiàn)，Nrf2/ARE通路的激活與細胞氧化應激有關[18]。人類絨毛外滋養(yǎng)層細胞在10%氧濃度低氧條件下24 h，Nrf2 mRNA表達顯著升高；在3%氧濃度低氧條件下，Nrf2 mRNA表達則顯著降低[6]。PC12細胞在適度低氧(10% O2)24 h后，細胞數(shù)目升高，總抗氧化能力有上升趨勢；而嚴重低氧(0.3% O2)24 h后，細胞數(shù)目顯著降低，總抗氧化能力明顯降低[19]。此外，實驗還發(fā)現(xiàn)，不同細胞對不同氧濃度低氧的反應不同，其調控的機制可能也不盡相同，有待進一步研究。

綜上所述，不同氧濃度下C2C12細胞中Nrf2介導的抗氧化系統(tǒng)對H2O2刺激反應不同，12 h的12% O2濃度可促進C2C12細胞Nrf2的抗氧化作用，而5% O2濃度的嚴重低氧則作用相反。