范春芳， 張紅霞， 唐逸豪， 徐海環(huán)， 宋 冬

(1. 中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心藥劑科， 天津 300162； 2. 中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心皮膚科， 天津 300162；3. 中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心， 天津 300162)

系統(tǒng)性硬化病(systemic scleroderma, SSc)屬于一種結(jié)締組織病，除皮膚硬化外，伴隨微血管病變、皮膚和內(nèi)臟纖維化是其主要的臨床表現(xiàn)，疾病進(jìn)展伴隨免疫系統(tǒng)的異常活化，其中以細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)為主。目前，臨床上治療SSc主要是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素來抑制免疫反應(yīng)，藥物不良反應(yīng)較多，療效并不理想[1]。研究表明活血化瘀中藥具有抑制膠原纖維過度增生的作用。中藥紅花具有擴(kuò)張血管、改善血液循環(huán)、抑制成纖維細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用，藥物不良反應(yīng)少[2-3]。本研究觀察了紅花對 SSc小鼠的影響，并探討了相關(guān)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物，60只6～7周雌性BALB /C小鼠，SPF 級，體質(zhì)量 18～20 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)在20～25℃室溫、40%～70%相對濕度的清潔環(huán)境中，5只/籠，12 h晝/夜循環(huán)照明。注射用鹽酸博來霉素(規(guī)格：15 mg/瓶，批號：140372，日本化藥株式會社)。中藥紅花(批號：140901，產(chǎn)地:新疆)采用常規(guī)方法加水煎煮并濃縮成濃度為1 g生藥 /ml的紅花水煎液。強(qiáng)的松片(規(guī)格:每片5 mg，批號：141123，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司)。小鼠IL-6、IL-17、CTGF、TGF-β ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；HYP試劑盒(南京建成生物工程研究所)。酶標(biāo)儀(BMG LRBTECH公司)；彩色病理圖像分析系統(tǒng)(日本Nikon公司)。

1.2 動物建模、分組及給藥

將60只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、強(qiáng)的松組、紅花低、中、高劑量組，每組10只。參考文獻(xiàn)[4-5]方法，將所有小鼠背部中央?yún)^(qū)部位毛發(fā)剃除，面積約2.0 cm × 2.0 cm，使用1 ml一次性無菌注射器在小鼠背部被毛區(qū)皮下，對照組小鼠注射100 μl 0.01 mol /L PBS(pH 7.2)，模型組和藥物治療組注射100 μl濃度為 200 μg /ml的注射用鹽酸博來霉素，每天1次，連續(xù)注射28 d。造模開始后即根據(jù)分組進(jìn)行藥物干預(yù)，對照組和模型組小鼠給予10 ml/kg生理鹽水灌胃，陽性藥物強(qiáng)的松組小鼠給予強(qiáng)的松4.5 mg/kg灌胃，紅花低、中、高劑量組小鼠分別給予紅花1.5、3、6 g/kg灌胃，所有小鼠每天灌胃給藥1次，灌胃10 ml/kg體積連續(xù)給藥28 d。小鼠自由飲食、飲水。

1.3 一般情況觀察

實驗過程中觀察各組小鼠的攝食飲水情況、自主活動情況、毛發(fā)、皮膚等一般情況觀察。

1.4 血清指標(biāo)檢測

各組小鼠最后一次給藥24 h，禁食、不禁水12 h，按3 ml/kg 腹腔注射2% 戊巴比妥鈉麻醉，固定，用剪刀剪開胸腹腔，使用1 ml一次性注射器穿刺左心室取血，放入未抗凝管內(nèi)，37℃靜置1～2 h，3 500 r/min離心15 min，取上清，-80℃保存。采用ELISA試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的要求，檢測血清中IL-6、IL-17的含量。

1.5 皮膚指標(biāo)檢測

各組小鼠心臟采血后，處死小鼠，切取背部注射區(qū)皮膚6 mm×6 mm大小，一部分加入生理鹽水剪碎后研磨成2%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用ELISA法檢測皮膚組織中因子CTGF、TGF-β含量，采用水解法檢測HYP含量；另一部分放入10%甲醛PBS溶液固定，脫水、石蠟包埋后進(jìn)行4 μm厚切片，按照試劑盒說明書的要求進(jìn)行HE染色，并采用彩色病理圖像分析系統(tǒng)對皮膚厚度進(jìn)行測量，皮膚厚度包括表皮和真皮層的厚度，每只小鼠的皮膚切片隨機(jī)取5處測量皮膚厚度，取平均值作為該小鼠的皮膚厚度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實驗過程中各組小鼠沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。對照組小鼠生長狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏；背部注射PBS區(qū)皮膚無硬化現(xiàn)象。模型組小鼠自發(fā)活動減少，精神狀態(tài)差；背部注射博來霉素區(qū)皮膚與皮下組織粘連，彈性差，顯著增厚變硬，毛發(fā)未見生長。強(qiáng)的松組、紅花治療組小鼠自發(fā)活動相對模型組增加，精神狀態(tài)良好，背部注射博來霉素區(qū)皮膚與皮下組織粘連減輕，皮膚變薄，彈性變大，毛發(fā)出現(xiàn)不同程度的生長。

2.2 各組小鼠皮膚真皮厚度

與對照組比較，模型組小鼠皮膚真皮厚度明顯升高；與模型組比較，強(qiáng)的松組和紅花低、中、高劑量組小鼠皮膚真皮厚度明顯降低(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Comparison of CTGF, TGF-β, HYP in skin n=10)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group；△P<0.05，△△P<0.01vsprednisone group；▲P<0.05，▲▲P<0.01vssafflower 1.5 g/kg group；○○P<0.01vssafflower 3 g/kg group

2.3 各組小鼠皮膚組織CTGF、TGF-β、HYP含量

與對照組比較，模型組小鼠皮膚組織CTGF、TGF-β、HYP含量均明顯升高；與模型組比較，強(qiáng)的松組和紅花低、中、高劑量組小鼠皮膚組織CTGF、TGF-β、HYP水平均明顯降低；與強(qiáng)的松組比較，紅花低、中、高劑量組CTGF含量和低、中劑量組HYP含量均明顯增加。紅花中、高劑量組CTGF、TGF-β含量和高劑量組HYP含量均較低劑量組明顯降低；紅花高劑量組CTGF較中劑量組明顯降低(P< 0.05，表1)。

2.4 各組小鼠血清 IL-6、IL-17水平

與對照組比較，模型組小鼠血清IL-6、IL-17水平均明顯升高；與模型組比較，強(qiáng)的松組和紅花低、中、高劑量組小鼠血清IL-6、IL-17水平均明顯降低；與強(qiáng)的松組比較，紅花中、高劑量組小鼠血清IL-17水平均明顯降低；紅花中、高劑量組小鼠血清IL-6、IL-17水平均較低劑量組明顯降低，紅花高劑量組小鼠血清IL-17水平較中劑量組明顯降低(P<0.05，表 2)。

GroupIL-6IL-17Control7.86±1.2418.85±3.51Model16.38±2.34??95.04±8.85??Prednisone12.39±1.52##61.72±7.51##Safflower 1.5 g/kg13.68±2.01#68.17±4.28##ΔSafflower 3 g/kg12.07±1.52##▲49.90±6.29##ΔΔ▲▲Safflower 6 g/kg11.23±2.16##▲40.96±7.79##ΔΔ▲▲○○

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P< 0.01vsmodel group；△P<0.05，△△P<0.01vsprednisone group；▲P<0.05，▲▲P<0.01vssafflower 1.5 g/kg group；

○○P<0.01vssafflower 3 g/kg group

3 討論

SSc 是一種慢性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要涉及成纖維細(xì)胞活化、微血管病變、免疫系統(tǒng)異常三個方面，皮膚纖維化為其主要臨床表現(xiàn)。在病變組織中T淋巴細(xì)胞活化、增殖，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，刺激成纖維細(xì)胞增殖、膠原增加，導(dǎo)致組織纖維化。IL-6是一種促炎、促纖維化的細(xì)胞因子，是T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期始動因素，與TGF-β一起誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為CD4+T細(xì)胞亞型即Th17細(xì)胞，能夠分泌具有強(qiáng)大的致炎作用的IL-17，又可以通過誘導(dǎo)、活化 T細(xì)胞、產(chǎn)生IL-6等多種炎性介質(zhì)，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。IL-6、IL-17 參與刺激成纖維細(xì)胞增生，導(dǎo)致組織纖維化[6]。

博來霉素是堿性糖肽類抗癌抗生素，能夠產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)組織纖維化的形成。本研究選用BALB /C小鼠，同通過皮下注射鹽酸博來霉素建立SSc 模型，并采用水解法檢測皮膚組織HYP的含量來反映膠原水平，結(jié)果顯示小鼠真皮厚度增加、HYP 含量增加，說明成功建立SSc小鼠模型；血清IL-6、IL-17水平升高，說明皮膚組織炎癥反應(yīng)促進(jìn)SSc的發(fā)生。

結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factpr-β，TGF-β)與SSc發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。SSc典型的臨床表現(xiàn)是皮膚增厚、纖維化，皮膚中CTGF mRNA表達(dá)顯著增高。TGF-β作為重要的促纖維化細(xì)胞因子，可直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、膠原基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。SSc患者成纖維細(xì)胞處于一種永久激活狀態(tài)，部分是受自分泌和旁分泌的CTGF和TGF-β的影響，拮抗CTGF和TGF-β可以防治纖維化，發(fā)揮治療SSc的作用。實驗結(jié)果表明，中藥紅花可以降低 BALB/C硬皮病小鼠皮膚組織中CTGF與TGF-β的含量，從而發(fā)揮防治皮膚纖維化的作用。紅花水煎液可改善血管通透性，減少血漿蛋白外滲，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生纖維化關(guān)鍵因子如結(jié)締組織生長因子(CTGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)等，從而減少成纖維細(xì)胞增殖和黏附和Ⅰ、Ⅲ型膠原合成及ECM沉積，抑制皮膚硬化[3]。

SSc尚無特效治療藥物，糖皮質(zhì)激素具有免疫抑制作用，是目前臨床上SSc治療性價比最高的藥物[7]。但糖皮質(zhì)激素治療SSc 的效果并不十分顯著，不宜長期使用，肢端型硬皮病、肺纖維化、腎損害患者禁用[8]。中藥紅花具有廣泛的藥理作用，能夠改善心腦血氧供應(yīng)減輕缺血性損傷，抗氧化、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等作用，臨床上多用于心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等疾病的治療[9]。紅花水煎液能抑制Th17細(xì)胞分化，減少IL-17分泌，從而抑制免疫炎癥反應(yīng)而具有抗皮膚纖維化的治療作用；紅花組真皮厚度的降低還可能與紅花抗氧化、清除氧自由基、改善血管微循環(huán)等多靶點、多環(huán)節(jié)的作用有關(guān)[10]。

本研究建立SSc小鼠模型，紅花進(jìn)行干預(yù)，同時選擇強(qiáng)的松作為陽性對照藥物，結(jié)果顯示紅花治療組、強(qiáng)的松組真皮厚度、皮膚組織HYP含量均降低，提示兩種藥物均可改善SSc小鼠皮膚纖維化。紅花治療組、強(qiáng)的松組皮膚組織CTGF、TGF-β含量及血清 IL-6、IL-17 水平均較模型組下降，說明兩種藥物均能減輕免疫炎癥，抑制組織纖維化的形成。綜上所述，紅花可改善 SSc 小鼠皮膚組織纖維化，降低皮膚組織CTGF、TGF-β、HYP含量及血清 IL-6、IL-17 水平可能是其作用機(jī)制之一。補(bǔ)充說明紅花水提取液的作用與陽性對照的優(yōu)劣及紅花水提取液的最佳劑量。