王汝歡， 周 茹， 丁 洋， 周振興

(1. 深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司， 廣東 深圳 518102； 2. 首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院 檢驗科， 北京 100015；3. 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 消化中心， 北京 100010； 4. 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 檢驗科， 北京 100010)

伴隨人們生活水平的提高，心腦血管疾病發(fā)病率逐年提高，由疾病伴隨的慢性腦缺血誘發(fā)血管性認知功能障礙嚴重威脅患者生活質量[1]。各種血管性因素(腦內血管低灌流、缺血、缺氧)導致不同比例或不同程度局灶性與彌漫性病變的白質損害為主的組織病理學特點；臨床表現出各種不同性質和類型的感覺與運動障礙以及執(zhí)行功能障礙，記憶和語言功能障礙相對較輕，人格保持完整，突出表現皮層下功能障礙?，F代醫(yī)學研究認為，早期干預慢性腦缺血的病理生理過程，可以延緩血管性認知功能障礙的進程，明顯改善患者生存質量，甚至避免血管性癡呆的發(fā)生。祖國中醫(yī)藥發(fā)展迅速，中藥對血管性認知功能障礙具有多途徑、多靶點的整體性治療作用優(yōu)勢，受到醫(yī)學研究者的重視[2]。氧化應激損傷是缺氧后血管性認知功能障礙發(fā)生主要的發(fā)病機制[3]。小檗堿亦稱黃連素，是從中藥黃連中分離的一種季銨生物堿，本研究采用結扎大鼠雙側頸總動脈建立血管性認知功能障礙模型，研究小檗堿對氧化應激損傷的治療作用，同時觀察了海馬中炎性因子的變化以及皮層中單胺類神經遞質的變化，了解小檗堿治療血管性認知功能障礙的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑

鹽酸小檗堿購自廣州威佳科技有限公司，純度：99%，批號：160810；5-羥色胺(5-HT)標準品購自中國生物藥品制品檢定所，批號：121656-201405；單胺氧化酶(MAO)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、谷胱甘肽(GSH)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒，均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20170623、20170520、20170220、20170412；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測試盒和白介素-1β(IL-1β)測試盒，購自優(yōu)而生公司，批號分別為L161123029、L160818450。

1.2 動物模型制備[4-5]

Wistar大鼠SPF級，健康雄性，68只，體重180～220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證編號為SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)條件：溫度(24±1)℃，相對濕度(50±10)%，明暗周期12 h，自由飲水、攝食。隨機分為正常組10只、假手術組10只、造模組48只。造模組腹腔注射2%戊巴比妥鈉3 ml/kg麻醉后，仰臥位固定在大鼠固定板上，頸部用理發(fā)器去除毛發(fā)，用酒精和碘酒依次消毒，頸部正中用剪刀剪開皮膚，向兩側分開頜下腺，用眼科鑷子鈍性分離兩側頸總動脈，放置手術線永久結扎兩側頸總動脈后，縫合皮膚，消毒后放回籠中飼養(yǎng)。假手術組僅分離兩側頸總動脈不結扎。大鼠在造模過程中出現死亡或活動異常影響實驗者予以剔除并進行隨機補充，以保證每組實驗動物數，其中，5只死于麻醉過量，2只死于手術時血管破裂出血過多，1只手術后出現肢體活動障礙予以剔除。造模組又隨機分為血管性認知功能障礙模型組和小檗堿低、中、高劑量治療組，每組10只。正常組、假手術組和模型組腹腔注射5 ml/kg生理鹽水，小檗堿低、中、高劑量治療組腹腔注射小檗堿20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg，5 mL/kg，每天1次，共34 d。大鼠認知功能采用Morris水迷宮實驗進行評價[6]。將假手術組大鼠的逃避潛伏期作為參考值，如果模型組大鼠逃避潛伏期與參考值之差與參考值的比值>20%，則可判斷模型成功[7]。實驗中，模型組和小檗堿各治療組大鼠均有缺失，模型組死亡2只，小檗堿各治療組各死亡1只，死亡時間均在開始腹腔給予小檗堿或生理鹽水后1周內。

1.3 Morris水迷宮實驗[8-9]

將Morri水迷宮直徑1.5 m、高0.6 m、水深設定為0.4 m，將水迷宮平分為4個象限，依次標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，頂部有圖像采集系統(tǒng)并于計算機相連。將平臺放置在Ⅳ象限，平臺低于水面2 cm。用空調控制室溫25℃，水溫控制在(25±1)℃。第一階段定位航行實驗(place navigation test, PNT)：共5 d。第29日，將平臺去除進行適應性游泳，每次2 min，上、下午各1次。第30～33日，將大鼠分別依次從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限面朝池壁放入水中，計時60 s，若大鼠在放入后60 s內找到并爬上平臺，則讓大鼠在平臺上停留10 s后，放回大鼠籠中休息；若大鼠在放入后60 s內沒有平臺，則將其放在平臺上停留15 s后，放回大鼠籠中休息。每天2次，上、下午各1次，共4 d。實驗目的是評價大鼠的空間獲得能力即學習能力，統(tǒng)計大鼠逃避潛伏期(escape latency，EL)，即從大鼠放入水中開始計時至大鼠爬上平臺所經歷的時間，未找到平臺的大鼠逃避潛伏期以60 s統(tǒng)計。第二階段空間探索實驗(spatial probe test, SPT)：去除平臺，將大鼠從Ⅱ象限面朝池壁放入水中，計時120 s。實驗目的是評價大鼠保持經驗的能力即記憶能力，統(tǒng)計大鼠從入水120 s內大鼠通過Ⅳ象限內平臺所在位置的次數。給藥28 d后進行第一階段定位航行實驗5 d，結束后第34日進行第二階段空間探索實驗，開展兩實驗期間大鼠正常給藥。

1.4 指標檢測

Morris水迷宮實驗結束后，大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，用剪刀斷頭，剪開皮膚后用剪刀順著骨縫剪開腦殼，用彎鑷取出大腦，放在冰盤上加冷藏的生理鹽水，用手術刀片切取前腦皮層組織，然后分離海馬組織。制備10%皮層組織高氯酸勻漿液，離心后采用高效液相色譜儀測定上清液中5-HT含量。按皮層濕重1∶10(mg：μl)預冷的生理鹽水制備10%皮層勻漿液，實驗在冰浴中進行，離心后取上清液，采用MAO檢測試劑盒檢測組織中MAO活性。按海馬濕重1∶10(mg：μl)預冷的生理鹽水制備10%海馬勻漿液，實驗在冰浴中進行，離心后取上清液，保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測海馬組織中SOD活性以及MDA、GSH、TNF-α、IL-1β的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行實驗操作。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 小檗堿對大鼠逃避潛伏期和穿過平臺次數的影響

模型組較假手術組大鼠逃避潛伏期顯著延長(P<0.01)，通過平臺次數顯著減少(P<0.01)；小檗堿各治療組較模型組大鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.01，P<0.05)，通過平臺次數明顯增加(P<0.01，P<0.05，表1)。小檗堿高劑量組第3、4日降低逃避潛伏期作用優(yōu)于低劑量組，與中劑量組相當；小檗堿低、中、高劑量組之間通過平臺次數沒有明顯差異。

Tab. 1 Effects of berberine on the escape latency and the times of passing through the platform of VCI model

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vssham-operated group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group;

▲P<0.05vsberberine 20 mg/kg group

2.2 小檗堿對大鼠海馬SOD活性和GSH、MDA含量的影響

模型組較假手術組大鼠海馬SOD、GSH顯著降低(P<0.01)，MDA顯著升高(P<0.01)；小檗堿各治療組較模型組大鼠SOD、GSH顯著升高(P< 0.01)，MDA顯著降低(P<0.01，表2)。小檗堿高劑量組升高SOD的作用優(yōu)于低劑量組，與中劑量組相當；小檗堿中、高劑量組升高GSH、降低MDA的作用相當，均優(yōu)于低劑量組。

Tab. 2 Effects of berberine on the levels of SOD activity, GSH and MDA in the hippocampus of VCI model

SOD: Superoxide dismutase; GSH: Glutathione; MDA: Malondialdehyde

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vssham-operated group;△P<0.05,△△P<0.01vsModel group;

▲P<0.05,▲▲P<0.01vsberberine 20 mg/kg group

2.3 小檗堿對大鼠海馬TNF-α、IL-1β的影響

模型組較假手術組大鼠海馬TNF-α、IL-1β明顯升高(P<0.01)；小檗堿各治療組較模型組大鼠TNF-α、IL-1β明顯降低(P<0.01，表3)。小檗堿高劑量組降低TNF-α的作用優(yōu)于低、中劑量組；小檗堿高劑量組降低IL-1β的作用優(yōu)于低劑量組，與中劑量組相當。

GroupnTNF-α IL-1β Normal10113.1±13.62.1±0.2Sham-operated10109.7±14.52.1±0.2Model8266.5±15.9??##6.9±0.9??##Berberine 20 mg/kg9217.6±13.5??##△△5.0±0.8??##△△Berberine 40 mg/kg9216.4±10.8??##△△4.7±0.6??##△△Berberine 60 mg/kg9202.3±9.5??##△△▲▲○○4.2±0.7??##△△▲

TNF-α: Tumor necrosis factor alpha; IL-1β: Interleukin-1 beta

*P<0.05,**P<0.01vsNormal group;#P<0.05,##P<0.01vsSham-operated group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsberberine 20 mg/kg group;○○P<0.01vsberberine 40 mg/kg group

2.4 小檗堿對前腦皮層5-HT含量和MAO活性的影響

模型組較假手術組大鼠前腦皮層5-HT含量明顯降低(P<0.01)，MAO活性明顯升高(P<0.01)；小檗堿各治療組較模型組大鼠5-HT含量明顯升高(P<0.01)，MAO活性明顯降低；小檗堿60 mg/kg 5-HT含量(P<0.01，表4)。小檗堿高劑量組升高5-HT含量的作用優(yōu)于低、中劑量組；小檗堿中、高劑量組降低MAO活性的作用優(yōu)于低劑量組，兩組的作用相當。

Groupn5-HT (ng/g)MAO(U/mg)Normal10434.1±25.420.8±2.3Sham-operated10428.0±23.421.1±2.1Model8219.3±18.4??##40.3±4.0??##Berberine 20 mg/kg9385.4±23.4??##△△30.3±4.5??##△△Berberine 40 mg/kg9403.7±14.6??#△△26.2±3.6??##△△▲Berberine 60 mg/kg9422.6±16.9△△▲▲○23.5±1.9?#△△▲▲

5-HT: 5-hydroxytryptamine; MAO: Monoamine oxidase

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P< 0.01vssham-operated group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsberberine 20 mg/kg group;

○P<0.05vsberberine 40 mg/kg group

3 討論

高血壓、高血脂、糖尿病等多種疾病可誘發(fā)血管性認知功能障礙，腦血流量的變化可能是其主要原因。血管性認知功能障礙主要表現為學習、記憶功能的降低。研究表明，血管性認知功能障礙可能與氧化應激損傷、炎癥反應、神經遞質紊亂等多重因素誘發(fā)神經元、白質的損害有關。大鼠實驗雙側頸總動脈結扎能夠較好地模擬臨床疾病腦血流障礙的臨床癥狀[10]，本研究采用此大鼠模型，評價模型大鼠的學習記憶功能，并分析相應的發(fā)病機制。

小檗堿能夠通過血腦屏障，在腦組織起到治療作用，為血管性癡呆的治療提供了物質基礎。小檗堿具有擴張缺血區(qū)微循環(huán)血管，改善缺血區(qū)血液供應的作用。從表1可見，本研究采用結扎大鼠雙側頸總動脈的方法成功制作血管性認知功能障礙模型大鼠，經小檗堿各劑量組治療4周后，大鼠的認知功能均得到顯著改善，并且呈現出劑量依賴性的作用趨勢。

在神經元缺血性損傷中，氧化應激損害起到主要作用。研究證實血管性認知功能障礙大鼠皮質和海馬區(qū)神經細胞線粒體氧化應激水平明顯升高[11]。超氧化物歧化酶SOD屬于一種金屬酶，廣泛存在于生物體內，可以歧化超氧離子，保護細胞不受機體內、外環(huán)境中超氧離子損傷的作用[12]。GSH可以直接與氧自由基結合，起到抗氧化的作用。丙二醛MDA，是一種醛類物質，是自由基脂質過氧化產物，對細胞具有嚴重的損害作用，能夠間接地反映機體的自由基代謝狀況，是判斷脂質過氧化程度的一個重要指標[13]。小檗堿是一種天然的生物堿，具有抗炎、抗菌、抗氧化作用[14-16]。從表 2可見，小檗堿具有明顯的抗氧化作用，在神經元缺血保護中起重要作用。

實驗證明，TNF-α和IL-1β等炎癥因子與學習記憶功能損傷密切相關[17-18]。腦缺血引起氧自由基損傷，激活腦組織內皮細胞和膠質細胞釋放炎性因子，誘發(fā)嗜中性粒細胞遷移到腦實質，加重腦損傷，增強氧自由基的損傷作用，形成惡性循環(huán)，進一步加重缺血對神經系統(tǒng)的損傷[19]。從表 3可見，小檗堿通過直接地抗氧化應激作用和阻斷炎癥通路相關炎性因子的釋放，雙重阻斷這種惡性循環(huán)，減少腦組織損傷。

中樞神經系統(tǒng)膽堿能神經遞質與學習記憶功能密切相關，單胺類神經遞質在其過程中起到易化作用[20]。五羥色胺是非常重要的單胺類神經遞質，其再攝取抑制劑能有效改善動物在Morris水迷宮中認知功能。從表 4可見，認知功能障礙模型組大鼠皮質中五羥色胺的含量明顯下降，單胺氧化酶活性明顯升高，而小檗堿治療4 周可明顯提高皮層五羥色胺的含量、降低單胺氧化酶的活性，改善單胺類神經遞質紊亂。

綜上所述，小檗堿能夠改善血管性認知功能障礙模型大鼠認知功能，具有減輕氧化應激損傷、減輕炎癥反應、調節(jié)單胺類神經遞質的作用。