張雯斐， 楊昌振， 胡鵬程， 陳 浩， 席 悅， 樊紅琨， 章 茜， 楊 春△

(1. 鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系， 河南 鄭州 450000； 2. 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)系， 河南 鄭州 450000)

高血壓是最常見的心血管病 ,是全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題，目前尚是人類無法解決的疾病之一。高血壓可引起機(jī)體許多器官產(chǎn)生疾病,其中以腦卒中和心肌梗死最常見[1]。2型小電導(dǎo)-Ca2+-激活-K+(2-type small conductance-Ca2+-activating-K+SK2)通道是哺乳動物細(xì)胞中一種非電壓依賴性鉀通道，SK2通道激活，K+外流，參與心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極化過程[2]。而高血壓是否引起心肌SK2通道表達(dá)變化未見報(bào)道。本研究用腹腔注射N’-硝基-L-精氨酸(N’-nitro-L-arginine L-NNA)的方法制備大鼠高血壓模型[3]，檢測心肌SK2通道蛋白的表達(dá)，探究SK2在高血壓引起心臟結(jié)構(gòu)功能變化的作用，為高血壓藥物靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

L-NNA試劑購自美國Sigma公司；兔多克隆SK2抗體購自以色列Alamone labs 試劑公司;辣根過氧化酶山羊抗兔lgG、蛋白預(yù)染Marker和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自中國北京康為公司;BCA (一種穩(wěn)定的水溶性復(fù)合物，可與Cu+結(jié)合生成紫色復(fù)合物)蛋白濃度測定試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 分組與建立高血壓動物模型

健康雄性成年SD 大鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心(生產(chǎn)許可證 SCXK(豫)2011- 0012，)使用許可證 SYXK(豫)2011-0012)，體重200 ～220 g。經(jīng)心電圖檢測正常后將動物隨機(jī)分為對照組(n=5)和實(shí)驗(yàn)組(n=7)。(原分組既定各5只大鼠，因擔(dān)心實(shí)驗(yàn)建模過程中實(shí)驗(yàn)組大鼠死亡，故多備兩只大鼠，后來大鼠全部存活，故實(shí)驗(yàn)組比對照組多兩只)實(shí)驗(yàn)組大鼠用L-NNA 15 mg/( kg·d ) 腹腔注射，連續(xù)應(yīng)用28 d，對照組腹腔注射等積生理鹽水。動物單獨(dú)飼養(yǎng)于通風(fēng)暗室房間，以日光燈控制光照周期(12 h:12 h)，室溫保持在 22～24℃，飼以普通飼料購自河南實(shí)驗(yàn)動物中心和飲用水。

1.3 大鼠血壓的監(jiān)測

尾套法血壓測量：將大鼠置于固定盒中，并用尾套置于鼠尾根部，脈搏傳感器傳感片緊貼鼠尾下方，然后將鼠尾及尾套預(yù)熱，同時(shí)等待大鼠安靜，待脈搏穩(wěn)定之后，使用球囊打氣加壓直至脈搏波呈直線，緩慢放氣，待脈搏波動出現(xiàn)時(shí)，此時(shí)測量的尾套內(nèi)氣體壓力值，即鼠尾動脈壓(arterial blood pressure, BP)[4]。

1.4 大鼠心電圖測量

大鼠經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛麻醉(4 ml/kg體重)后固定于鼠板上，將針形電極刺入四肢皮下，采用Rm6240型多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)連續(xù)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，測量P波時(shí)長、P-R間期、QRS時(shí)長、R-R間期。每只大鼠給藥前稱重并記錄四肢導(dǎo)聯(lián)心電圖，給藥后每周測量一次心電圖。4周末給大鼠稱重并記錄心電圖后處死。

1.5 大鼠心臟取材

給藥第4周末，大鼠測量心電圖后，用10% 水合氯醛腹腔注射麻醉(4 ml/kg體重)，暴露心臟，快速取出心臟。通過大鼠癥狀表現(xiàn)、血壓變化、心電圖判斷模型制備是否成功，制備成功的大鼠取出心臟后放入液氮中，提取心臟組織蛋白做 Western blot。

1.6 Western blot 的檢測

以1∶9的比例在心臟中加入組織勻漿液制備蛋白樣品，提取的蛋白樣品加入5×loading buffer，99℃煮沸5 min，100 g/L SDS-PAGE分離膠上樣后100 V電泳3 h；取下凝膠，4℃恒壓(100 V)電轉(zhuǎn)2 h。取下PVDF膜(Bio-Rad公司)，50 g/L脫脂牛奶-TBS室溫封閉1 h，隨即加入兔多克隆抗SK2抗體(按1∶150稀釋，Sigma公司)4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(按1∶5 000稀釋，Thermo公司)室溫孵育2 h，TBST漂洗，ECL化學(xué)發(fā)光曝光顯影[5]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體重的比較

給藥前實(shí)驗(yàn)組大鼠體重為(210±11)g，對照組為(205±10)g，兩組體重差異無顯著性。給藥四周末稱重，實(shí)驗(yàn)組大鼠體重增加較少，均值為(390±21)g，對照組大鼠體重(403±19)g，增加較多，兩組無顯著性差異。

2.2 高血壓模型大鼠癥狀的表現(xiàn)

與對照組大鼠相比，給藥第2周開始部分實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)毛色發(fā)黃，無光澤，呼吸頻率加快，煩躁不安，口唇發(fā)紺，尿少，尿黃等癥狀。給藥第4周所有實(shí)驗(yàn)組大鼠均出現(xiàn)上述癥狀。

2.3 兩組大鼠血壓的比較

給藥前分別給12只大鼠測血壓，對照組和實(shí)驗(yàn)組血壓如表1顯示，兩組之間無顯著性差異。給藥后1、2、3、4周分別檢測各組大鼠血壓，結(jié)果顯示，與給藥前相比，對照組血壓變化無顯著性差異(P<0.05)；第3、4周實(shí)驗(yàn)組大鼠血壓明顯高于對照組(P<0.05)。

2.4 兩組大鼠心電圖的比較

結(jié)果顯示給藥前12只大鼠心電圖結(jié)果均在正常范圍內(nèi)(圖1A)。與給藥前比較，從第1周到第4周對照組大鼠心電圖均無明顯變化(圖1B)，而實(shí)驗(yàn)組大鼠在第2周有1只大鼠心電圖出現(xiàn)變化，有2只在第3周出現(xiàn)變化，到第4周心電圖均出現(xiàn)不同程度的變化(圖1C)，心電圖測量結(jié)果顯示高血壓大鼠QRS時(shí)長和R-R間期延長，并有不同程度的ST段抬高或T波高聳(表2)。

Tab. 1 The blood pressure between two groups(mmHg,

*P<0.05vscontrol group

Tab. 2 The results of ECG(ms,

ECG: Electrocardiogram

*P<0.05vscontrol group

Fig.1Electrocardiogram(ECG) in control group and experimental group

A: Before the experiment; B: Control group before execution at 4 weeks; C: Experimental group before execution 4 weeks

2.5 兩組大鼠心肌SK2通道蛋白的表達(dá)水平的比較

如圖2顯示，4周后對照組和實(shí)驗(yàn)組的大鼠心肌組織均在約 60 KD處有印跡條帶(圖2)。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠心房組織和心室組織SK2通道的表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。

Fig.2The expression of small conductance Ca2+-activated-K+channel subtype 2 proteins(SK2) in the hypertensive rats

A: Atria of control group; B: Atria of experimental group; C: Ventricle of control group; D: Ventricle of experimental group

GroupnAtriaVentricleControl group50.52±0.090.99±0.22Experimental group71.12±0.18?1.64±0.26?

*P<0.05vscontrol group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射L-NNA導(dǎo)致一氧化氮缺乏的方法制備高血壓動物模型。 NO是一種很強(qiáng)的舒血管物質(zhì)，能降低全身平均動脈血壓，控制全身各種血管床的靜息張力，增加腎血流量等，一旦其功能異常則可引起高血壓等一系列心血管的病理改變。現(xiàn)已證實(shí)，心肌和心內(nèi)膜細(xì)胞中均含有NO，心臟內(nèi)產(chǎn)生的NO對心臟功能有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。而L-NNA是NO合酶抑制劑,可以抑制NO的合成。本實(shí)驗(yàn)利用此方法制備高血壓大鼠模型，與對照組相比，給藥3周后實(shí)驗(yàn)組大鼠血壓升高且具有顯著性差異,說明該模型大鼠符合高血壓大鼠疾病模型條件。

高血壓引起心肌細(xì)胞Ca2+超載是高壓力負(fù)荷致心肌舒縮功能障礙的重要病理生理機(jī)制。肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵(calcium pump of Sarcoplasmic reticulum SERCA)調(diào)節(jié)Ca2+的釋放、攝取與儲存,心肌細(xì)胞興奮時(shí),細(xì)胞外Ca2+通過鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),誘發(fā)肌質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+,細(xì)胞內(nèi)Ca2+大于或等于10-5mol/L時(shí),Ca2+與心肌肌鈣蛋白結(jié)合,使心肌細(xì)胞收縮。心肌細(xì)胞收縮末期,啟動肌質(zhì)網(wǎng)上的鈣泵,攝取細(xì)胞內(nèi)鈣儲存于肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi),使游離Ca2+下降,心肌舒張。有研究發(fā)現(xiàn)[7]，鈣超載導(dǎo)致的血管功能異常是高血壓的發(fā)病基礎(chǔ)，也是誘發(fā)高血壓并發(fā)癥的一個(gè)重要因素。

SK2 通道是哺乳動物細(xì)胞中一種非電壓依賴性鉀通道，存在于心肌細(xì)胞上,其中SK2亞型主要表達(dá)在心房[8]，對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的改變具有很強(qiáng)的親合性，當(dāng)胞漿中的Ca2+濃度升高時(shí)，通過Ca2+與鈣調(diào)蛋白連接誘導(dǎo)構(gòu)象改變，SK2通道激活，K+外流，參與心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極化過程[9]，尤其發(fā)生于動作電位復(fù)極晚期，此期相當(dāng)于心肌細(xì)胞興奮性的相對不應(yīng)期和超常期，而臨床發(fā)生的心律失常多見于此期，本實(shí)驗(yàn)提取高血壓模型大鼠心肌組織，通過Western blot方法測定高血壓模型大鼠心肌組織 SK2 通道蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示心房組織和心室組織SK2 表達(dá)顯著高于對照組，提示高血壓心肌細(xì)胞內(nèi)鈣失衡影響SK2通道蛋白表達(dá)情況進(jìn)而對心臟結(jié)構(gòu)功能產(chǎn)生影響。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的改變引起鈣調(diào)蛋白、蛋白激酶或蛋白磷酸化酶的改變，而這些物質(zhì)均可以調(diào)節(jié)SK2通道的功能和表達(dá)，從而引起心肌內(nèi)SK2通道表達(dá)量的變化。

心電圖測量結(jié)果顯示高血壓大鼠QRS時(shí)長和R-R間期延長，提示其可能有心室肥厚和緩慢性心律失常，可以提示高血壓大鼠SK2通道蛋白表達(dá)升高可引起心肌功能的變化[10]，從而導(dǎo)致或者誘發(fā)心律失常，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SK2通道蛋白表達(dá)異?？梢鹦募」δ艿淖兓?，可能是導(dǎo)致高血壓模型大鼠出現(xiàn)心律失常的機(jī)制之一。對SK2通道的深入研究有助于進(jìn)一步揭示其在高血壓疾病中的作用機(jī)制，為高血壓疾病的治療和預(yù)后提供新的思路和策略，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。