谷成燕，賀艷麗，白若琬，韓保萍

（山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，山東 濟(jì)南 250101）

氯化鈉滴眼液的主要成分為氯化鈉，其次還含有玻璃酸鈉等成分，主要用于緩解眼睛疲勞引起的局部干澀。該滴眼劑為多劑量劑型，制劑中加入了抑菌劑苯扎氯銨。為控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證滴眼液的用藥安全，需要對(duì)苯扎氯銨的含量進(jìn)行控制。本文依據(jù)美國(guó)藥典苯扎氯銨[1]含量測(cè)定的色譜條件，對(duì)進(jìn)樣體積及流速進(jìn)行了優(yōu)化，根據(jù)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[2]及美國(guó)藥典34＜621＞[1]的要求，對(duì)該方法進(jìn)行了系統(tǒng)適用性、專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性和范圍及耐用性的驗(yàn)證，結(jié)果表明，該法能有效測(cè)定本品苯扎氯銨含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型液相色譜儀，Waters 2998 PDA檢測(cè)器（美國(guó)沃特世公司）；Agilent Technologies 1260 infinity液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；BP211D電子天平（賽多利斯）；XP205電子分析天平（梅特勒-托利多）；FE-20 S20K型酸度計(jì)（梅特勒-托利多）；DHG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器）；YB-3型澄明度檢測(cè)儀（天津大學(xué)精密儀器廠）。

1.2 試藥

氯化鈉滴眼液（山東博士倫福瑞達(dá)）；苯扎氯銨對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)201102，按C22H40ClN計(jì)，每1 ml中含苯扎氯銨為11.10 mg）；注射用玻璃酸酶（1500單位/瓶，上海上藥第一生化藥業(yè)）；無(wú)水醋酸鈉，冰醋酸（分析純，天津科密歐）；乙腈（色譜純，Dikma Tech）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 空白溶液 按處方組份及比例（除氯化鈉外）配制。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密量取苯扎氯銨對(duì)照品適量，用水定量稀釋制成每1 ml中含30 μg溶液。

2.1.3 供試品溶液 供試品用注射用玻璃酸酶酶解[3-4]（酶解溫度為37±0.5 ℃，酶濃度為60單位/ml，酶解時(shí)間為20 min）后直接進(jìn)樣。

2.2 色譜條件及優(yōu)化

2.2.1 美國(guó)藥典苯扎氯銨測(cè)定色譜條件 用氰基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以醋酸鈉溶液（無(wú)水醋酸鈉8.2 g，加水1000 ml使溶解，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0）-乙腈（55：45）為流動(dòng)相；流速為2 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為262 nm。

該色譜條件下苯扎氯銨的測(cè)定濃度為4 mg/ml，進(jìn)樣體積為20 μl，則進(jìn)樣量為80 μg，本品中苯扎氯銨濃度為30 μg/ml，選用最大進(jìn)樣體積100 μl，則進(jìn)樣量為3 μg。試驗(yàn)結(jié)果表明，該色譜條件下，苯扎氯銨拖尾因子為1.0～1.3，相鄰峰之間分離度為2.0～2.1，系統(tǒng)適用性符合要求。

2.2.2 參數(shù)選擇及優(yōu)化

2.2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 從供試品全波長(zhǎng)掃描光譜圖可知，苯扎氯銨在209 nm與262 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收。因流動(dòng)相中含有的醋酸鹽在酸性條件下形成醋酸（吸收波長(zhǎng)為210 nm），其濃度遠(yuǎn)高于分析物，導(dǎo)致其210 nm處強(qiáng)烈的底吸收完全掩蓋了苯扎氯銨的紫外吸收，為避免209 nm處流動(dòng)相的干擾，選擇262 nm作為苯扎氯銨含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)，與中國(guó)藥典妥布霉素滴眼液等[5]品種下苯扎氯銨含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)一致。

2.2.2.2 流速的選擇 由于本品中苯扎氯銨含量較低，為提高測(cè)定的準(zhǔn)確度，需選擇較高的靈敏度，提高峰面積的響應(yīng)因子，而當(dāng)進(jìn)樣量一定時(shí)，PDA檢測(cè)器的積分響應(yīng)值（峰面積）與流動(dòng)相流速成反比[6]，因此需選擇較低的柱流速進(jìn)行含量測(cè)定。依據(jù)中國(guó)藥典常見(jiàn)流速，設(shè)定流速為1 ml/min，并將測(cè)定結(jié)果與流速為2 ml/min進(jìn)行比較。在不同的流速下測(cè)定同一供試品中苯扎氯銨的含量，其一致性為99.6 %。苯扎氯銨峰的響應(yīng)因子隨著流速的增大而減小，流速為1 ml/min的響應(yīng)因子約為2 ml/min的2倍。為增大其響應(yīng)因子，提高測(cè)定的靈敏度與準(zhǔn)確度，選擇流速為1 ml/min。

2.2.2.3 進(jìn)樣體積的選擇 為使方法具有良好的分離度與檢測(cè)靈敏度，需選擇合適的進(jìn)樣量。進(jìn)樣量過(guò)大，可能導(dǎo)致色譜柱超載，致使樣品峰展寬，峰形改變；進(jìn)樣量過(guò)小，又可能導(dǎo)致方法靈敏度過(guò)低。本品中含苯扎氯銨濃度僅為0.003 %，因此采用直接進(jìn)樣對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，為避免進(jìn)樣量對(duì)分離及測(cè)定結(jié)果的影響，需選擇合適的進(jìn)樣體積。通過(guò)不同進(jìn)樣體積的供試品溶液的重復(fù)性結(jié)果與苯扎氯銨拖尾因子大小，為保證良好的重復(fù)性，同時(shí)減小柱負(fù)載，選擇進(jìn)樣體積為80 μl。

2.3 專屬性試驗(yàn)

2.3.1 酸（堿、氧化）破壞 取本品及苯扎氯銨空白各8 ml，分別置入安瓿，加1 mol/L鹽酸溶液（1mol/L氫氧化鈉溶液、3 %過(guò)氧化氫溶液）各1 ml，搖勻，密封，室溫放置48 h，取出，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液（1 mol/L鹽酸溶液、水）1 ml，得約80 %濃度供試品溶液。

2.3.2 高溫（光照）破壞 取本品及苯扎氯銨空白各適量，分別置安瓿（石英器皿）中，密封，于60 ℃烘箱（照度為3500 lx日光燈）中放置48 h，取出，放冷。

2.3.3 試驗(yàn)結(jié)果 溶劑及空白溶液對(duì)本品中苯扎氯銨測(cè)定無(wú)干擾，破壞試驗(yàn)后空白溶液在苯扎氯銨峰處無(wú)新的色譜峰。由表1可見(jiàn)，破壞后供試品中苯扎氯銨色譜峰純度角均小于純度閾值。

表1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 耐用性試驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)藥典色譜條件系統(tǒng)適用性要求，對(duì)流動(dòng)相pH值、緩沖鹽濃度及比例、檢測(cè)波長(zhǎng)、進(jìn)樣體積、柱溫、色譜柱及流速進(jìn)行考察。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可見(jiàn)，變化前后，各色譜條件下供試品中苯扎氯銨含量測(cè)定結(jié)果的RSD為0.3 %～1.6 %（n=6），對(duì)照品溶液分離度及拖尾因子均符合要求。

2.5 線性

精密量取苯扎氯銨適量，置入100 ml量瓶，加水定量稀釋制成每1 ml中含0.6 mg溶液，作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量，分別加水定量稀釋制成每1 ml含15，22.5，30，36，45 μg溶液，作為線性溶液。精密量取各線性溶液80 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。用峰面積（Y）對(duì)線性溶液濃度（X）進(jìn)行線性回歸，線性方程為Y= 4994.9X-2248.1，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取苯扎氯銨對(duì)照品適量，用空白溶液制成50 %，100 %和150 %苯扎氯銨濃度水平的溶液，作為供試品溶液。另精密量取苯扎氯銨對(duì)照品適量，加水定量稀釋制成每1 ml中含30 μg溶液，作為對(duì)照品溶液。每種濃度水平的溶液分別制備3份。各濃度水平的回收率見(jiàn)表3。結(jié)果顯示回收率良好。

表3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 精密度試驗(yàn)

2.7.1 進(jìn)樣精密度 取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積及保留時(shí)間的RSD。苯扎氯銨峰面積的RSD為0.4 %，峰1保留時(shí)間的RSD為0.2 %，峰2保留時(shí)間的RSD為0.2 %。

2.7.2 重復(fù)性 取本品適量，作為供試品溶液，平行制備6份；另精密量取苯扎氯銨對(duì)照品適量，加水定量稀釋制成每1 ml中含30 μg溶液，作為對(duì)照品溶液。6份供試品中苯扎氯銨含量測(cè)定結(jié)果的RSD為0.4 %。

2.7.3 中間精密度 由不同分析人員在不同的日期使用不同的儀器進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。試驗(yàn)者I和試驗(yàn)者II的共12份供試品溶液中苯扎氯銨含量測(cè)定結(jié)果的RSD為0.8 %，二者的平均一致性為99.6 %。

2.8 范圍

根據(jù)線性、準(zhǔn)確度、精密度等試驗(yàn)結(jié)果，確定本法的適用范圍為50 %～150 %（以相當(dāng)于供試品溶液濃度百分比計(jì)）。

3 討論

（1）苯扎氯銨系廣譜殺菌劑，是滴眼液中比較常見(jiàn)的防腐劑，化學(xué)名稱為氯化二甲基芐基烴銨，屬季銨基類化合物。中國(guó)藥典收載的妥布霉素滴眼液與硫酸新霉素滴眼液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均有苯扎氯銨含量測(cè)定方法，二者色譜條件完全一致，但是色譜條件中添加了掃尾劑三乙胺以減小峰拖尾，由于三乙胺會(huì)對(duì)色譜柱的性質(zhì)造成一種不可逆轉(zhuǎn)的改變[7]，因此使其不再適合應(yīng)用于流動(dòng)相中不含三乙胺成分的檢測(cè)，所以本品參照《美國(guó)藥典》中苯扎氯銨的測(cè)定方法，優(yōu)化后確定了本品中苯扎氯銨的測(cè)定方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法可行。

（2）苯扎氯銨為氯化烷基二甲基芐銨的混合物，主要由3種正烷烴基（n-C12H25、n-C14H29、n-C16H33）取代的二甲基芐基氯化銨的同系物組成[8]，采用中檢院對(duì)照品在我們的色譜條件下有3個(gè)色譜峰，而樣品只有一個(gè)色譜峰，可能與國(guó)產(chǎn)原料有關(guān)。實(shí)際測(cè)定時(shí)，保留時(shí)間為為3.8 min的色譜峰信噪比S/N約為6.7，低于定量限，為準(zhǔn)確定量，在計(jì)算本品中苯扎氯銨含量時(shí)，不將此峰計(jì)算在內(nèi)。按同系物峰面積的和值計(jì)算含量。典型圖譜見(jiàn)圖1～2 。

圖1 苯扎氯銨中檢院對(duì)照品

圖2 苯扎氯銨國(guó)產(chǎn)原料