鄭國燦 ,徐亞龍 ,董浩然 ,趙 爽 ,宮敬禹

(1.重慶大學分析測試中心,重慶 401331; 2.重慶大學化學化工學院,重慶 401331;3.重慶大學材料科學與工程學院,重慶 400044; 4.重慶登康口腔護理用品股份有限公司,重慶 400025)

苯扎氯銨是一種季銨鹽類陽離子殺菌劑,是由正烷烴基取代的二甲基芐基氯化銨的同系物組成,主要以十二烷基二甲基芐基氯化銨(C12-BAC)、十四烷基二甲基芐基氯化銨(C14-BAC)和十六烷基二甲基芐基氯化銨(C16-BAC)為主。3種同系物具有不同的殺菌特性,C12-BAC 對酵母菌和真菌具有抑制作用,C14-BAC和C16-BAC 對革蘭氏陽性菌和陰性菌具有抑制作用[1],3種同系物往往配合使用,被廣泛應用于醫(yī)用產(chǎn)品、化妝品、日化用品中。苯扎氯銨對眼睛、皮膚具有強烈的刺激性,過量使用會引起人身傷害,GB 22115－2008《牙膏用原料規(guī)范》和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)規(guī)定化妝品及牙膏中苯扎氯銨的限量均為0.1%(質(zhì)量分數(shù))。

目前苯扎氯銨的測定方法主要有紫外分光光度法[2]、毛細管電泳法[3-4]、高效液相色譜法[5-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等。紫外分光光度法易受樣品基質(zhì)的干擾,且只能測定苯扎氯銨總量;毛細管電泳法試劑消耗量少,但方法的穩(wěn)定性易受樣品介質(zhì)和基質(zhì)的影響;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀器設備昂貴,但靈敏度較高,適用于禁用苯扎氯銨產(chǎn)品的分析;高效液相色譜法因其儀器設備具有普適性被廣泛采用,其靈敏度適合化妝品[5,8]、包裝材料[7]、日化用品[9]、醫(yī)用產(chǎn)品[10-11]等限用苯扎氯銨產(chǎn)品的測定。在高效液相色譜法中,常用C18柱[7,9,11]、氰基(CN)柱[6,8,10]、強陽離子(SCX)柱[5]作為分離色譜柱,其中CN 柱和SCX 柱,因其對苯扎氯銨具有較好特異性而被經(jīng)常采用,而C18柱對苯扎氯銨的特異性較差,往往需添加離子對試劑作為流動相,以改善峰形和選擇性。鑒于目前牙膏中苯扎氯銨含量的測定方法報道較少,本工作采用高效液相色譜法,以CN 柱分離,利用二極管陣列檢測器測定牙膏中C12-BAC、C14-BAC和C16-BAC 等3 種苯扎氯銨同系物的含量,本方法前處理簡單,靈敏度和選擇性較好,可為牙膏質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20A 型液相色譜儀,配二極管陣列檢測器(DAD);H1850R 型冷凍離心機;VORTEX 2型渦旋振蕩器;DY-10-240DTL型超聲波清洗機。

3種苯扎氯銨同系物的標準儲備溶液:10.0 g·L－1,分別稱取3 種苯扎氯銨同系物的對照品各1.000 0 g,以適量甲醇溶解后,用甲醇定容至100.0 mL,于4 ℃保存。使用時用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

C12-BAC、C14-BAC 和C16-BAC 對照品的純度不小于99.5%;所用試劑均為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

GL Sciences CN-3色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫30 ℃;檢測波長260 nm;進樣量10μL;流量1.0 mL·min－1。流動相為乙腈與0.1 mol·L－1乙酸銨溶液以體積比1∶1組成的混合液;等度洗脫。

1.3 試驗方法

稱取市售牙膏樣品1.000 0 g于50 mL 尖嘴離心管中,加數(shù)顆玻璃珠,加甲醇10 mL,渦旋振蕩2 min,使牙膏完全分散,再超聲提取10 min,在8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速下離心5 min,上清液經(jīng)0.45μm 有機微孔濾膜過濾后,取濾液按色譜條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按色譜條件對3種苯扎氯銨同系物的混合標準溶液進行測定,色譜圖見圖1。

圖1 3種苯扎氯銨同系物混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 3 homologues of benzalkonium chloride

按試驗方法對空白樣品和加標樣品進行分析,色譜圖見圖2。

由圖1和圖2可見:在色譜條件下,3種苯扎氯銨同系物均達到完全分離,峰形良好。

2.2 提取溶劑及提取方式的選擇

苯扎氯銨易溶于水、醇等極性溶劑,而牙膏基質(zhì)比較復雜,選擇提取溶劑時需要充分考慮牙膏的溶解性和分散性。

圖2 樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of the samples

試驗中采用水、甲醇、乙醇、乙腈等4種提取溶劑對牙膏陽性樣品進行提取。試驗結(jié)果表明:水能夠完全分散牙膏樣品,牙膏樣品溶液黏稠;甲醇能部分溶解牙膏樣品,基質(zhì)中碳酸鈣等無機鹽不溶解,牙膏樣品溶液的分散性較好;乙醇也能部分溶解牙膏樣品,牙膏樣品溶液的分散性較甲醇作為提取溶劑時牙膏樣品溶液的分散性差;乙腈作為提取溶劑時,牙膏樣品溶液的分散性最差,牙膏樣品成坨狀。苯扎氯銨的提取效率由大到小依次為甲醇、水、乙醇、乙腈。試驗選擇提取溶劑為甲醇。

采用渦旋振蕩和超聲提取相結(jié)合的方式對苯扎氯銨進行提取,提取時加入玻璃珠,使牙膏樣品進行充分分散與溶解。

試驗中考察了牙膏樣品的渦旋時間和超聲時間對苯扎氯銨提取效率的影響。結(jié)果表明:牙膏樣品渦旋振蕩2 min、超聲提取10 min就能進行充分的分散與溶解,苯扎氯銨的提取效率最高。試驗中牙膏樣品渦旋振蕩2 min、超聲提取10 min。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱

苯扎氯銨的分離可以采用C18柱、CN 柱、SCX柱等不同類型的色譜柱。使用C18柱時,流動相需要添加庚烷磺酸鈉作為離子對試劑[7,11],或者加入三乙胺作為掃尾劑[9],以改善峰形和選擇性。為了簡化流動相體系,試驗以乙腈-乙酸銨體系作為流動相(等度洗脫),考察了CN 柱、SCX 柱對3種苯扎氯銨同系物的分離情況。

結(jié)果表明:采用CN 柱、SCX 柱時,3種苯扎氯銨同系物的分離情況以及峰形等比較類似。試驗選擇色譜柱為CN 柱。

2.3.2 流動相

根據(jù)文獻[10],試驗采用乙腈-乙酸銨體系作為流動相(等度洗脫)。試驗首先用乙酸調(diào)節(jié)流動相的酸度,考察了流動相的酸度對樣品中雜質(zhì)和3種苯扎氯銨同系物分離的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 流動相的酸度對樣品中雜質(zhì)和3種苯扎氯銨同系物分離的影響Fig.3 Effect of acidity of mobile phase on separation of impurities and 3 homologues of benzalkonium chloride in sample

由圖3 可知:隨著pH 的增加,樣品中雜質(zhì)和3種苯扎氯銨同系物的分離度越來越大;當pH 增加至6～7時,樣品中所有雜質(zhì)的保留時間均小于3種苯扎氯銨同系物的保留時間,3種苯扎氯銨同系物的測定完全不受雜質(zhì)干擾。這可以確定在接近中性的條件下雜質(zhì)的保留行為和3種苯扎氯銨同系物的保留行為有較大的區(qū)別。為了進一步簡化流動相的配制,試驗選擇流動相的pH 約為7,即流動相中不加乙酸。

試驗其次考察了流動相中乙腈的比例對樣品中雜質(zhì)和3 種苯扎氯銨同系物分離的影響。結(jié)果表明:乙腈的比例從45%增至65%(以5%幅度遞增)時,樣品中雜質(zhì)和3種苯扎氯銨同系物均能完全分離,即樣品中雜質(zhì)不干擾3種苯扎氯銨同系物的分離;乙腈的比例大于65%時,3種苯扎氯銨同系物不能完全分離。由試驗結(jié)果還可知:乙腈的比例對3種苯扎氯銨同系物的保留時間和峰形有較大的影響,乙腈比例越高,3種苯扎氯銨同系物的保留時間越短,分離度也變小,特別是雜質(zhì)峰與C12-BAC 的分離度。流動相中乙腈的比例為50%,55%,60%時,3種苯扎氯銨同系物的保留時間和分離度均比較理想。試驗選擇流動相中乙腈的比例為50%。

試驗最后考察了乙酸銨的濃度對樣品中雜質(zhì)和3種苯扎氯銨同系物分離的影響。結(jié)果表明:隨著乙酸銨濃度的增大,3種苯扎氯銨同系物的分離度逐漸減小,但是峰形越來越好,保留時間越來越小,其與樣品中干擾峰的分離度也越來越小;乙酸銨的濃度為0.1 mol·L－1時,3種苯扎氯銨同系物的峰形較對稱。試驗選擇乙酸銨的濃度為0.1 mol·L－1。

2.3.3 柱溫

柱溫較高能減少分析時間,但柱溫越高,目標物的分離度越小。試驗考察了柱溫依次為20,25,30,35,40 ℃時,3種苯扎氯銨同系物的分離情況。結(jié)果表明:柱溫為20,25,30 ℃時,3種苯扎氯銨同系物的峰形基本差異不大,隨著柱溫的升高,3種苯扎氯銨同系物的分離度小幅減小,但都達到基線分離,整體保留時間逐漸變小;柱溫為35 ℃時,C16-BAC的峰形開始稍稍變差;柱溫為40 ℃時,C16-BAC 的峰形變?yōu)槠脚_峰。因此,柱溫不應超過35℃。由試驗結(jié)果還可以看出:柱溫較低時不會影響3種苯扎氯銨同系物的分離度和峰形;柱溫越低,3種苯扎氯銨同系物的保留時間越長。試驗選擇柱溫為30℃?？紤]到實際的試驗條件,若儀器沒有配備柱溫箱或者柱溫箱沒有制冷的功能,應控制環(huán)境溫度不超過35 ℃。

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

按色譜條件對5,10,20,50,100,200,500 mg·L－1的3種苯扎氯銨同系物的混合標準溶液系列進行測定,并繪制標準曲線。結(jié)果表明:3種苯扎氯銨同系物的質(zhì)量濃度均在5～500 mg·L－1內(nèi)與其對應的峰面積呈線性關系,線性回歸方程和相關系數(shù)見表1。

根據(jù)3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N),根據(jù)10倍信噪比計算方法的測定下限(10S/N),結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和測定下限Tab.1 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收試驗

按試驗方法對空白牙膏樣品(樣品基質(zhì)依次為碳酸鈣、磷酸二氫鈣、二氧化硅)進行加標回收試驗,加標量為100,1 000,2 000 mg·kg－1,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表2。

由表2可知:回收率為97.4%～107%,RSD 為0.21%～5.2%。

2.6 樣品分析

按試驗方法對不同基質(zhì)的20種市售牙膏樣品進行分析,其中6種牙膏樣品檢出3種苯扎氯銨同系物,其余14種牙膏樣品均未檢出3種苯扎氯銨同系物,所檢陽性樣品中3種苯扎氯銨同系物的含量均未超過國家標準1 000 mg·kg－1的限量,均為合格。

本工作建立了測定牙膏中3種苯扎氯銨同系物含量的HPLC-DAD 方法。本方法前處理簡單、分析快速,可用于實際樣品分析,易在基層檢測單位推廣使用。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)