李佳紅 費東生 于 未 楊松林 趙鳴雁

膿毒癥的主要病理生理學(xué)變化是嚴(yán)重全身感染引起的炎性反應(yīng)過度激活、免疫功能紊亂及凝血機能障礙[1]。免疫功能紊亂尤其是免疫功能抑制被認(rèn)為是膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，而且貫穿膿毒癥始終。其中免疫細(xì)胞凋亡是膿毒癥免疫抑制狀態(tài)發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一，并直接影響膿毒癥患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸[2]。膿毒癥可顯著降低B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和濾泡樹突狀細(xì)胞的水平，分別導(dǎo)致抗體生成減少、巨噬細(xì)胞活化降低和抗原遞呈下降。淋巴細(xì)胞的消失尤為重要，因為它們的缺失使機體發(fā)生感染概率增加。基于對炎性反應(yīng)和膿毒癥認(rèn)識的變化，免疫調(diào)理治療看來是解決膿毒癥的根本途徑，但無論賴以指導(dǎo)治療的免疫學(xué)指標(biāo)還是糾正免疫紊亂的手段目前都還處在起步階段，而且十分有限[3]。Hotchkiss等研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥能夠加速淋巴細(xì)胞凋亡并耗竭脾T淋巴細(xì)胞,免疫細(xì)胞凋亡與凋亡蛋白(Fas、caspase-9等)的表達(dá)有關(guān)，通過表達(dá)膿毒癥大鼠模型凋亡蛋白基因，可以減少膿毒癥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡。由此，調(diào)控免疫細(xì)胞的凋亡過程有可能改善膿毒癥模型的免疫抑制狀態(tài)，改善預(yù)后[4]。

CO作為第二種氣體信號分子，在膿毒癥時能介導(dǎo)產(chǎn)生一系列細(xì)胞保護作用，在抗炎、抗凋亡、抗氧化過程中扮演著重要的角色。很多研究都證明CO的吸入提高了由盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)、內(nèi)毒素(LPS)、糞腸球菌或大腸桿菌等誘導(dǎo)的敗血癥嚙齒動物的存活率。在膿毒癥小鼠中CO的供體化合物即外源性CO釋放分子可以發(fā)揮類似的保護作用。值得注意的是，CO對膿毒癥的抑制作用不僅限于嚙齒動物模型，也包括在大型動物模型中，例如豬和非人類的LPS或肺炎鏈球菌的靈長類動物模型[5]。且現(xiàn)有研究證明HO-1和外源性CO對膿毒癥中細(xì)胞凋亡有影響和作用，通過觀察HO-1/CO系統(tǒng)干預(yù)MAPKS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化對免疫細(xì)胞凋亡的影響，從基因-蛋白-功能方面揭示HO-1/CO系統(tǒng)對于膿毒癥免疫抑制調(diào)節(jié)機制，對于膿毒癥治療的探索及預(yù)防MODS的發(fā)生將具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用前景[6]。CO通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路參與細(xì)胞生長、增殖、分化及凋亡等重要的生物學(xué)過程，其中ERK信號通路是經(jīng)典的MAPKs途徑，主要調(diào)控細(xì)胞增殖與分化；而JNK和p38通路在多種應(yīng)激因子作用下均可激活，發(fā)揮介導(dǎo)細(xì)胞炎癥、凋亡等多種生物效應(yīng)，p38通路下游的凋亡蛋白(Fas、caspase-9、caspase-3等)參與淋巴細(xì)胞的凋亡，這為本研究提供了一定的理論基礎(chǔ)[7]。本研究將應(yīng)用LPS處理大鼠建立體內(nèi)膿毒癥炎性反應(yīng)模型，觀察外源性CO對LPS處理后各膿毒癥大鼠模型T淋巴細(xì)胞凋亡與凋亡蛋白(Fas、caspase-9、caspase-3)的表達(dá)的關(guān)系，觀察外源性一氧化碳對膿毒癥模型凋亡蛋白(Fas、caspase-9、caspase-3)的表達(dá)的影響，進(jìn)而探討外源性一氧化碳釋放分子2對膿毒癥模型T淋巴細(xì)胞凋亡的影響。

材料與方法

1.實驗動物:雄性Wistar大鼠28只，體重250～300g，由筆者醫(yī)院動物實驗中心提供,人工控制條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為22℃，每日光照時間為12h(7:00～19:00)，取食和飲水無限制。

2.藥物、試劑與儀器：脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；CORM-2購自美國BD公司；APC Mouse Anti-Rat CD4、PE Mouse Anti-Rat CD8a Clone OX-8、 FIFC Mouse Anti-Rat CD3 Clone G4.18購自美國BD公司；Fas、caspase-3、caspase-9及小鼠β-actin單克隆抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔、小鼠抗小鼠抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞儀來自筆者醫(yī)院中心實驗室。

3.藥物的配置:CORM-2的制備,用500μl DMSO溶解 10.25mg CORM-2配制成 CORM-DMSO溶液,然后將其溶解于等體積等滲生理鹽水中[8]。iCORM-2(無活性的CORM-2)溶液的制備,用DMSO溶劑充分溶解CORM-2，室溫下放置2天，再通入氮氣去除溶液內(nèi)殘余的CO。LPS溶液的制備,將10mg LPS粉末溶于10ml生理鹽水,溶液濃度10mg/ml。

4.動物分組、模型制備及給藥：采用數(shù)字表法將大鼠隨機分為4組，即陰性對照組、LPS組、LPS+CORM-2組、LPS+iCORM-2組。腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉大鼠，經(jīng)腹腔注射LPS建立膿毒癥模型，經(jīng)腹腔給予配制的CORM-2與iCORM-2 6mg/kg建立LPS+CORM-2與LPS+iCORM-2模型，陰性對照組：不進(jìn)行任何處理；LPS組：經(jīng)大鼠腹腔注射LPS，劑量為10mg/kg；LPS+CORM-2組經(jīng)腹腔注射LPS，劑量為10mg/kg，待0.5h后經(jīng)腹腔注射給予配置的CORM-2 6mg/kg；LPS+iCORM-2組經(jīng)腹腔注射LPS，劑量為10mg/kg，待0.5h后經(jīng)腹腔給予配制的iCORM-2 6mg/kg，經(jīng)相應(yīng)試劑預(yù)處理24h后終止實驗，留取所需實驗樣本。

5.實驗過程:給予相應(yīng)試劑預(yù)處理，在24h后，收集血液、脾臟、小腸等標(biāo)本，觀察大鼠小腸光鏡下結(jié)果進(jìn)行模型驗證；將抗凝血進(jìn)行流式細(xì)胞檢測；將部分脾臟4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，觀察病理改變；其余脾臟組織置于-80℃冰箱備用做Western blot法檢測蛋白的表達(dá)。

6.觀察和檢測指標(biāo):(1)觀察大鼠小腸光鏡下結(jié)果進(jìn)行模型驗證。(2)外周血T細(xì)胞亞群檢測：在流式細(xì)胞儀上用射門法觀察和計數(shù)CD4與CD8標(biāo)記陽性T細(xì)胞數(shù)，計算CD4/CD8陽性細(xì)胞比值(CD4+/CD8+)，從大鼠的血標(biāo)本 100μl抗凝血，分別加入1μg熒光標(biāo)記的單克隆抗體 CD4-APC/CD8-PE/CD3-FIFC混勻，室溫避光孵育15～30min，加入2ml 1×RBC Lysis Buffer，搖勻后室溫避光孵育15min,300×g離心5min，棄上清，PBS 500μl懸浮，送筆者醫(yī)院中心實驗室用流式細(xì)胞儀檢測CD3+CD4+、CD3+CD8+的絕對值及CD4+/CD8+的比值。(3)取脾臟病理學(xué)觀察，取脾臟組織 10%甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，普通光鏡下觀察脾臟組織的情況。(4)Western blot法檢測Fas、caspase-3、caspase-9蛋白的表達(dá)：BCA法測蛋白濃度，取25μg蛋白進(jìn)行不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜，洗膜，加入相應(yīng)的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測，以β肌動蛋白作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1.模型的驗證:與陰性對照組大鼠比較，LPS組大鼠小腸明顯充血水腫伴大量炎性細(xì)胞浸潤，24h后膿毒癥模型造模成功(圖1、圖2)。

圖1 陰性對照組大鼠24h后小腸光鏡下病理形態(tài)結(jié)果小腸絨毛排列有序，尖聳致密，腸腔內(nèi)極少量炎性滲出以及中性粒細(xì)胞浸潤，形態(tài)正常(HE染色，×200)

圖2 LPS組大鼠24h后小腸光鏡下病理形態(tài)結(jié)果小腸絨毛變短，排列基本整齊，但充血、水腫明顯，可見炎性細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)微血栓形成(HE染色，×200)

2.膿毒癥患者T淋巴細(xì)胞亞群變化:分析膿毒癥患者 T 淋巴細(xì)胞各亞群構(gòu)成比的變化，與陰性對照組比較，LPS組CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)；與陰性對照組比較，LPS組CD4+/CD8+比值明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與LPS組比較，LPS+CORM-2組CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+CORM-2組CD4+/CD8+比值明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+iCORM-2組CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與LPS組比較，LPS+iCORM-2組CD4+/CD8+比值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果(圖3)。

表1 膿毒癥患者 T 淋巴細(xì)胞亞群構(gòu)成比的變化

與陰性對照組比較,*P<0.05；與LPS組比較,#P<0.05

圖3 流式細(xì)胞儀檢測膿毒癥大鼠陰性對照組、LPS組、LPS+CORM-2組、LPS+iCORM-2組CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡及兩者的比值

3.病理形態(tài)學(xué)觀察:陰性對照組大鼠脾臟紅、白髓結(jié)構(gòu)清晰，小梁結(jié)構(gòu)明顯,白髓內(nèi)含有大量淋巴小結(jié)；LPS組與LPS+iCORM-2組脾臟紅、白髓分界尚清，脾白髓淋巴細(xì)胞減少，脾小結(jié)體積變?。籐PS+CORM-2組較LPS組脾索增寬，其內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，同時淋巴結(jié)淋巴濾泡生發(fā)中心增大(圖4)。與陰性對照組比較，LPS組T淋巴細(xì)胞明顯減少；與LPS組比較，LPS+CORM-2組T淋巴細(xì)胞明顯增加，陰性對照組與LPS+iCORM-2組比較，T淋巴細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5)。

圖4 各組大鼠HE染色脾臟組織病理切片A.陰性對照組(×40);B.LPS組(×200);C.LPS+CORM-2組(×200);D.LPS+iCORM-2組(×200)

4.外源性一氧化碳2對膿毒癥模型凋亡蛋白Fas/Fasl、caspase-9、caspase-3的表達(dá)的影響。與陰性對照組比較，LPS組與LPS+iCORM-2組的Fas、caspase-9和caspase-3的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+CORM-2組Fas、caspase-9和caspase-3的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+iCORM-2組的Fas、caspase-9和caspase-3的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)。

圖5 各組T淋巴細(xì)胞相對百分?jǐn)?shù)與陰性對照組比較，LPS組T淋巴細(xì)胞明顯減少，與LPS組比較，LPS+CORM-2組T淋巴細(xì)胞明顯增加

討 論

免疫功能紊亂尤其是免疫功能抑制被認(rèn)為是膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，而且貫穿膿毒癥始終。Hotchkiss等[10]研究顯示膿毒癥患者脾臟大量的淋巴細(xì)胞凋亡，且在最近的膿毒癥動物模型以及死于膿毒癥和多器官衰竭的患者中，已經(jīng)證明了膿毒癥通過細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞大量丟失[9～12]。在目前的研究中，膿毒癥中淋巴細(xì)胞的凋亡可能是削弱免疫系統(tǒng)的原因，進(jìn)而導(dǎo)致了炎性反應(yīng)爆發(fā)[11,13]。膿毒癥主要誘導(dǎo)各種淋巴細(xì)胞亞群，即B細(xì)胞、CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞，研究了脾臟CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞的凋亡情況[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠24h后與陰性對照組比較，脾臟淋巴細(xì)胞明顯減少，即出現(xiàn)了免疫抑制，導(dǎo)致炎癥的爆發(fā)；經(jīng)外源性一氧化碳釋放分子2干預(yù)后，膿毒癥大鼠脾臟淋巴細(xì)胞明顯增加，外源性一氧化碳釋放因子2可削弱免疫抑制作用，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。

圖6 Western blot法檢測膿毒癥大鼠各凋亡蛋白的表達(dá)與陰性對照組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

HO體系是內(nèi)源性CO產(chǎn)生的主要體系。HO-1被誘導(dǎo)后其表達(dá)增加的幅度可高達(dá)100倍，具有抗氧、抗炎、抑制血小板凝集、細(xì)胞保護、調(diào)節(jié)血管張力等重要作用，在維持組織和細(xì)胞功能以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定上有著廣泛的生理作用[15]。有研究提示通過CORM釋放的外源性CO能夠緩解內(nèi)毒素型和多重感染型膿毒癥的急性炎癥。相關(guān)研究使用LPS或者盲腸結(jié)扎穿孔模型(CLP)，CORMs輸注能夠減少這些類型膿毒癥模型的病死率。輸注CORM-2能夠增加野生小鼠的噬菌作用，在CLP后24h輸注能在Hmox1-/-小鼠膿毒癥模型中起到保護作用[16]。CO亦可減少促凋亡蛋白p53表達(dá)和線粒體釋放細(xì)胞色素C抑制凋亡，故CO可作為凋亡抑制劑。CO通過調(diào)控JNK和p38通路發(fā)揮介導(dǎo)細(xì)胞炎癥、凋亡等多種生物效應(yīng),進(jìn)而再通過Fas/Fasl途徑調(diào)控淋巴細(xì)胞的凋亡[17,18]。因而了解細(xì)胞凋亡的確切途徑將有助于發(fā)現(xiàn)治療膿毒癥的新療法，細(xì)胞凋亡的起始有兩個主要途徑，分別Fas/Fas配體介導(dǎo)的caspase-8通路和caspase-9通路，caspase-8或caspase-9隨后激活caspase-3，經(jīng)共同途徑最終將導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的凋亡[13,18]。Fas(CD95)/Fas配體(CD95L)系統(tǒng)是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一個關(guān)鍵。

Fas通過其配體FasL的結(jié)合可以誘導(dǎo)caspase-9激活并導(dǎo)致下游激活半胱天冬酶隨后切割關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)caspase-3等導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的凋亡[14,19]。本研究經(jīng)此通路發(fā)現(xiàn)在膿毒癥大鼠組(Fas、caspase-9、caspase-3)凋亡蛋白明顯增加，加速了T淋巴細(xì)胞的凋亡，免疫反應(yīng)受抑制，在經(jīng)外源性一氧化碳釋放分子2干預(yù)后,凋亡蛋白(Fas、caspase-9、caspase-3)表達(dá)明顯減少，T淋巴細(xì)胞凋亡減少，增強了免疫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮其抗炎作用。

綜上所述,膿毒癥大鼠在受到CORM-2干預(yù)后,引起凋亡蛋白(Fas、caspase-9、caspase-3)表達(dá)的明顯減少,說明外源性一氧化碳釋放分子2能夠在膿毒癥模型中抑制凋亡蛋白的表達(dá),且在CORM-2干預(yù)組的膿毒癥大鼠T淋巴細(xì)胞較膿毒癥組明顯增加,即通過Fas/Fasl配體調(diào)控下游的(caspase-9、caspase-3)抑制T淋巴細(xì)胞的凋亡,外源性一氧化碳釋放分子2通過抑制凋亡蛋白的增加而有效的削弱了膿毒癥對T淋巴細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。由此可以說明外源性一氧化碳釋放分子2通過抑制凋亡蛋白的表達(dá)減少T淋巴細(xì)胞的凋亡。

此外，本研究的創(chuàng)新點為闡述了外源性一氧化碳對膿毒癥模型的免疫系統(tǒng)方面的作用,證實了外源性CO通過抑制凋亡蛋白的表達(dá)減少T淋巴細(xì)胞的凋亡，這也為外源性CO的抗凋亡作用提供了新的理論基礎(chǔ)，外源性CO誘導(dǎo)的抗凋亡作用可能涉及其他的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(其上游P38通路等)，本研究仍有不足,需要在今后開展的研究中進(jìn)一步證實。