饒鳳琴， 程玉梅， 吳昌學(xué)， 王義， 崔古貞， 齊曉嵐**， 洪偉**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&貴州省分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 綜合ICU， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.美國(guó)奧本大學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué)系， 美國(guó) 奧本 阿拉巴馬 36849； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

艱難梭菌(Clostridioidesdifficile)是一種革蘭陽(yáng)性、產(chǎn)芽孢、專性厭氧棒狀桿菌，在1935年首次由Hall和O`Toole[1]從新生兒糞便樣品中分離得到。艱難梭菌感染(Clostridioidesdifficileinfection, CDI)的主要癥狀有腹瀉、腹痛、發(fā)燒、中毒性巨結(jié)腸及腸道穿孔等。2002年C.difficile強(qiáng)毒株的出現(xiàn)(核糖體BI/NAP1/027型，同時(shí)產(chǎn)生毒素A、毒素B和二元毒素CDT)，導(dǎo)致CDI的致病率與致死率顯著提高[2-4]，成為醫(yī)院獲得性感染中的首要疾病。大約有4%～10%的患者在住院前就攜帶了產(chǎn)毒素艱難梭菌菌株，艱難梭菌表達(dá)的毒素A(Toxin A，腸毒素)和毒素B(Toxin B，細(xì)胞毒素)是艱難梭菌的主要毒力因子。PaLoc毒力基因島(pathogenicity locus，PaLoc)編碼了2個(gè)毒力基因tcdA及tcdB和3個(gè)調(diào)控基因(tcdR、tcdE及tcdC)，3個(gè)調(diào)控基因共同調(diào)控tcdA及tcdB基因的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)的毒力艱難梭菌菌株都表達(dá)tcdB基因，tcdA基因在某些毒株中選擇性表達(dá)。串聯(lián)規(guī)律間隔短回文序列(cluster regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)和CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein, Cas)組成的CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一種RNA介導(dǎo)的細(xì)菌和古菌免疫系統(tǒng)[5]。在最近幾年，來(lái)源于Streptococcuspyogenes的CRISRPR-Cas9元件被廣泛應(yīng)用于原核生物和真核生物的精確基因編輯[5-19]。與CRISPR-CAS9系統(tǒng)相似，CRISPR-Cpf1系統(tǒng)是基于Cpf1核酸內(nèi)切酶的免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)最初在FrancisellanocididaU112菌株中被發(fā)現(xiàn)[17]，后經(jīng)改造后成為高效的艱難梭菌基因編輯工具[20-21]。本研究使用CRISPR-Cpf1系統(tǒng)成功敲除了艱難梭菌菌株P(guān)aLoc毒力島(包含tcdR、tcdB、tcdE、tcdA及tcdC基因)，成功構(gòu)建了去除毒素表達(dá)能力的C.difficile菌株，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要菌株、儀器及試劑

菌株NEB express大腸桿菌購(gòu)于New England BioLabs公司，艱難梭菌 630菌株從美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)購(gòu)買。儀器及試劑為基因?qū)雰x(Bio-Rad，美國(guó))、厭氧產(chǎn)氣袋(MGC AnaeroPack，日本)、厭氧培養(yǎng)盒(MGC Anaero Pack，日本)、限制性核酸內(nèi)切酶BtgZI(New England Labs)、NEBuilder?HiFi DNA Assembly Master Mix試劑盒(New England Labs)、腦心浸出液(brain heart infusion, BHI ，Solarbio)、酵母粉(Oxoid，英國(guó))、瓊脂粉(Solarbio)。

1.2 方法

1.2.1菌株培養(yǎng)條件 艱難梭菌放于厭氧培養(yǎng)盒中，并放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋，厭氧培養(yǎng)盒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃靜置培養(yǎng)(液體培養(yǎng)8～12 h，固體平板培養(yǎng)18～24 h)。大腸桿菌菌株培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中，必要時(shí)添加氯霉素(6 mg/L)及卡那霉素(50 mg/L)。C.difficile培養(yǎng)于補(bǔ)充了5 g /L酵母提取物和1 g/L半胱氨酸腦心浸出液培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)。適當(dāng)時(shí)候補(bǔ)充以下抗生素/誘導(dǎo)物：甲砜霉素(15 mg/L)、D環(huán)絲氨酸(250 mg/L)、頭孢西丁(8 mg/L)及乳糖(40 mmol/L)。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建 本研究中使用的所有質(zhì)粒及引物見表1。分別用引物擴(kuò)增PaLoc毒力島上下游同源臂和sRNAP::crRNA，電泳檢測(cè)后，膠回收目的條帶。BtgZI酶切載體pWH34，使其線性化。用NEBuilder?HiFi DNA Assembly Master Mix試劑盒將PaLoc毒力島上下游同源臂、sRNAP::crRNA及線性化pWH34載體重組連接，產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，菌落PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，并計(jì)算陽(yáng)性率(陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子數(shù)與挑取的轉(zhuǎn)化子數(shù)的比值)。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，收取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為所構(gòu)建的目的載體。

1.2.3接合轉(zhuǎn)化艱難梭菌及突變體的篩選 取1 mL含有pWH34質(zhì)粒的大腸桿菌CA434，6 000 r/min離心3 min，然后用無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基洗滌2次。細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至厭氧箱與200 μL新鮮的艱難梭菌混合?；靹蚝簏c(diǎn)至無(wú)抗性BHIS瓊脂平板，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)10 h，培養(yǎng)平板加入0.5 mL BHIS液體培養(yǎng)基，刮下混合菌液，取100 μL涂布至含有15 mg/L甲砜霉素、250 mg/L D環(huán)絲氨酸及8 mg/L頭孢西丁的BHIS瓊脂平板；37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h，將菌落挑取并接種到含有15 mg/L甲砜霉素的BHIS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，將細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)稀釋，取100 μL稀釋涂到包含15 mg /L甲砜霉素及40 mmol/L乳糖的BHIS培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h，隨機(jī)挑選菌落并利用菌落PCR篩選?；蚪M編輯效率為突變體的數(shù)量與抗性菌落的比值×100%。

1.2.4質(zhì)粒丟失 將含有質(zhì)粒的突變體接種到BHIS培養(yǎng)基中進(jìn)行再培養(yǎng)(5 d內(nèi)約轉(zhuǎn)接10次)，然后劃線至固體培養(yǎng)基，挑取單菌落點(diǎn)于BHIS及含有15 mg/L甲砜霉素的BHIS固體培養(yǎng)基(平板影印法)。選擇對(duì)甲砜霉素敏感的菌落，在BHIS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。通過PCR進(jìn)一步證實(shí)這些突變體是否為質(zhì)粒丟失的突變株。

1.2.5突變株的基因型鑒定 為了驗(yàn)證突變株基因型的正確性，以表1中的6、7為檢測(cè)引物，突變株基因組為模板， 進(jìn)行PCR驗(yàn)證，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性20 s、55 ℃退火30 s、68 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，68 ℃徹底延伸10 min。電泳鑒定后送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表1 質(zhì)粒、引物序列及來(lái)源

2 結(jié)果

2.1 PaLoc毒力島敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

圖1 A所示為構(gòu)建pWH53質(zhì)粒所需基因元件的克隆，其中1、2泳道為PaLoc毒力島上下游同源臂(長(zhǎng)度分別為1 048 bp，1 036 bp)，3泳道為sRNAP::crRNA片段，4泳道為BtgZI酶切后的線性化pWH34質(zhì)粒。以上4個(gè)片段使用NEBuilder?HiFi DNA Assembly Master Mix試劑盒一步重組連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌NEB Express感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子挑取16個(gè)克隆PCR檢測(cè)，其中10/16為陽(yáng)性克隆，這些克隆擴(kuò)增后提取質(zhì)粒獲得PaLoc打靶質(zhì)粒pWH53(圖1B)。該質(zhì)粒包含可在大腸桿菌-艱難梭菌中穿梭復(fù)制的復(fù)制子、traJ接合轉(zhuǎn)化元件、甲砜霉素抗性基因(catP)、iLacP::Cpf1和sRNAP::crRNA表達(dá)框，質(zhì)粒大小為13 055 bp(圖1B)。

注：A為構(gòu)建pWH53質(zhì)粒所需基因元件的克隆，B為克隆擴(kuò)增后提取質(zhì)粒獲得PaLoc打靶質(zhì)粒pWH53。

2.2 pWH53質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及突變株篩選

包含pWH53質(zhì)粒的大腸桿菌CA434細(xì)胞與艱難梭菌 630細(xì)胞進(jìn)行接合轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率為0.25×103CFU/L。獲得pWH53質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子后，首先挑取艱難梭菌 630轉(zhuǎn)化子接入具有甲砜霉素抗性的BHIS培養(yǎng)基中，以維持pWH53質(zhì)粒在艱難梭菌630菌株中的穩(wěn)定傳代(圖2A)；再將艱難梭菌630轉(zhuǎn)化子菌液稀釋100～1 000倍后涂布于含有乳糖的BHIS-甲砜霉素培養(yǎng)基中，以誘導(dǎo)Cpf1蛋白的表達(dá)(圖2A)。ΔPaLoc基因敲除菌株經(jīng)在無(wú)抗性的BHIS培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接10次后丟失pWH53質(zhì)粒，獲得穩(wěn)定的ΔPaLoc突變株。擴(kuò)增ΔPaLoc突變株與艱難梭菌 630 WT基因組DNA：第1泳道以ΔPaLoc突變株基因組DNA為模板，第2泳道以艱難梭菌 630基因組DNA為模板，第3泳道為以ddH2O為模板的對(duì)照。泳道M為DNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，由于以艱難梭菌 630基因組DNA為模板時(shí)擴(kuò)增片段太長(zhǎng)(26 487 bp)因此無(wú)擴(kuò)增條帶(圖2B)。

注：A為質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及突變株篩選示意圖，B為擴(kuò)增ΔPaLoc突變株及630基因DNA電泳結(jié)果，M為DNA mark，1為ΔPaLoc DNA，2為630 DNA，3為對(duì)照。

2.3 ΔPaLoc突變株基因型鑒定

將ΔPaLoc突變株獲得擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如圖4所示。使用Vector NTI軟件比對(duì)上游同源臂、下游同源臂與ΔPaLoc突變株上下游同源臂重組位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)ΔPaLoc突變株相應(yīng)位點(diǎn)為上下游同源臂嵌合體序列，說明上下游同源臂之間的PaLoc毒力島被完整敲除(圖3A)。并且相應(yīng)位置(上下游同源臂的連接點(diǎn))的測(cè)序峰圖文件(圖3B)測(cè)序信號(hào)清晰，提示ΔPaLoc構(gòu)建成功。

注：A為Vector NTI軟件化對(duì)結(jié)果，B為測(cè)序結(jié)果。

3 討論

艱難梭菌是醫(yī)院獲得性腹瀉的主要誘因，攝入抗生素的住院患者是CDI的危險(xiǎn)人群。艱難梭菌的毒力因子主要由PaLoc毒力基因島編碼，包括tcdR、tcdB、tcdE、tcdA及tcdC5個(gè)基因。本研究使用CRISPR-Cpf1技術(shù)成功敲除了長(zhǎng)達(dá)26 487 bp的PaLoc毒力島。相比于CRISPR-Cas9技術(shù)[22]，CRISPR-Cpf1技術(shù)因不需要tracRNA的參與，Cpf1編碼基因更小，因此具有更高的接合轉(zhuǎn)化效率，另外，CRISPR-Cpf1技術(shù)更適合于編輯大基因片段。Hong等[20]報(bào)道，使用該技術(shù)成功敲除了接近50 kb的基因片段。相比基于反義RNA[23]、Clostron[24-25]、CodA[26]、ACE[27]等技術(shù)，CRISPR系統(tǒng)具有更高的基因編輯效率和更操作等優(yōu)點(diǎn)。

PaLoc毒力島tcdR、tcdB、tcdE、tcdA及tcdC基因中，其中的tcdA及tcdB編碼主要的毒力因子TcdA及TcdB。2種毒素都可以于腸上皮細(xì)胞頂端接合，后通過內(nèi)化作用進(jìn)入細(xì)胞，引起腸細(xì)胞骨架變化，導(dǎo)致上皮屏障松動(dòng)和細(xì)胞間連接被破壞。細(xì)胞間連接的破壞使得細(xì)胞間連接變得松散，TcdA、 TcdB毒素有機(jī)會(huì)進(jìn)一步侵入腸上皮細(xì)胞。毒素作為遠(yuǎn)外源物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致吞噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和各種免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，導(dǎo)致炎癥和中性粒細(xì)胞的積累，引發(fā)炎癥并最終導(dǎo)致CDI癥狀的發(fā)生[28]。敲除PaLoc毒素島后突變株不再產(chǎn)生致病毒素，并且該突變株因細(xì)胞壁及細(xì)胞壁蛋白仍然完整，因此并未丟失免疫原性，因此該ΔPaLoc突變株有望進(jìn)一步開發(fā)為全菌疫苗。

然而，活菌疫苗的構(gòu)建僅僅敲除ΔPaLoc毒力島可能還不夠。如最近的研究發(fā)現(xiàn)，有的強(qiáng)艱難梭菌毒株除了攜帶PaLoc毒力島，表達(dá)TcdA、TcdB毒素外，還表達(dá)二元毒素肌動(dòng)蛋白特異性ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶毒素(actin-specific ADP-ribosyltransferase toxin, CDT；如強(qiáng)毒株NAP1/BI/027)。CDT毒素由CdtLoc毒力島編碼，通常位于PaLoc毒力基因島下游，由cdtR、cdtA及cdtB基因組成。cdtA及cdtB基因分別編碼CDTa(酶組分)和CDTb(黏附組分)，亦對(duì)CDI的發(fā)生有貢獻(xiàn)。因此在未來(lái)的工作中，課題組將進(jìn)一步編輯ΔPaLoc突變株敲除CdtLoc毒力島，并進(jìn)一步完成表型及動(dòng)物模型試驗(yàn)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，在獲得的16株轉(zhuǎn)化子中，有8株為敲除PaLoc突變株，陽(yáng)性率為50%；通過測(cè)序驗(yàn)證，獲得的8株敲除PaLoc突變株均在設(shè)計(jì)位點(diǎn)發(fā)生了等位雙交換，成功構(gòu)建艱難梭菌毒性毒力島敲除PaLoc突變株。